儿童呼吸道感染者支原体、衣原体套式聚合酶链反应联合检测的研究

1、儿童呼吸道感染者支原体、衣原体套式聚合酶链反应联合检测的研究【摘要】目的探讨儿童呼吸道感染者的生殖支原体(Mg)、肺炎支原体(Mpn)、肺炎衣原体(Cpn)感染以及混合感染情况。方法采用套式聚合酶链反应(PCR)检测技术，检测231例儿童咽试子标本的Mg DNA、Mpn DNA、Cpn DNA，并对Cpn、Mg各2例阳性标本和其相对应的国际典型株作了DNA测序分析。结果231例患儿的Mg、Mpn、Cpn感染阳性率分别是22.5、30.7、32.9，混合感染阳性率分别为：Mg+Mpn为5.2，Mg+Cpn为2.6，Mpn+Cpn为10.8，Mg+Mpn+Cpn为8.7。其中2例Cpn阳性标本与国

2、际典型株进行DNA测序对比完全相同，1例Mg DNA有一个碱基突变，同源性达99.8，另1例完全相同。结论Mg可能是儿童呼吸道感染的病原体，病原体并可存在Mg、Mpn、Cpn三种病原体的混合感染。【关键词】儿童呼吸道感染支原体衣原体聚合酶链反应Study on combined detection of M.genitalium, M.pneumoniae and C.pneumonia by nested polymerase chain reaction in respiratory tract infections in pediatric patientsLU Yahua, MENG

3、Ping, DING Yan, et al.The Third Hospital of Su zhou Medical College, Changzhou 213003【Abstract】ObjectiveTo study the respiratory tract infections by Mg, M. genitalium (Mpn), Cpn, and co-infections by these agents in pediatric patients. MethodsMg DNA, Mpn DNA and Cpn DNA were detected in respiratory

4、tract specimens obtained by throat swab from 231 children by the nested polymerase chain reaction (PCR) technique. DNA sequencings were detected and analysed between every two positive specimens of Mg and Cpn and typical strains. ResultsPositive rates of Mg DNA、Mpn DNA and Cpn DNA by nested PCR in 2

5、31 children were 22.5%, 30.7% and 32.9%. The Positive rates of co-infection were 5.2% (Mg and Mpn), 2.6% (Mg and Cpn), 10.8% (Mpn and Cpn) and 8.7% (Mg and Mpn and Cpn). There was only one base mutation in 1 Mg DNA. Other DNA sequencings were same as those from model strains. The homogeneity was 99.

6、8%. ConclusionsMg could be one of the pathogens in respiratory tract infections in pediatric patients. There exists co-infection by Mg, Mpn and Cpn.【Key words】ChildrenRespiratory tract infectionMycoplasmaChlamydiaPolymerase-chain reaction肺炎支原体(Mpn)和肺炎衣原体(Cpn)是人类急性呼吸道感染的病原体之一。据资料表明，生殖支原体(Mg)与人类的男、女性泌

7、尿生殖道炎性疾病相关。近年又有学者从生殖道以外的病灶中分离到Mg。为探讨儿童呼吸道感染疾病中Mg的感染情况，以及与Mpn、Cpn是否存在混合感染，我们应用套式聚合酶链反应（PCR）技术，对231例儿童呼吸道感染者的咽试子标本进行联合检测，同时为确定套式PCR扩增的可靠性，分别对Cpn、Mg各2例阳性标本和国际典型株进行了DNA测序分析。对象与方法一、对象随机选择1997年8月1998年2月呼吸道感染住院患儿231例，男135例，女96例。其中肺炎134例，急性支气管炎35例，急性上呼吸道感染62例，诊断标准参见文献1。二、材料Mg套式PCR试剂盒(靶基因为Mg 16S rRNA基因)、Mpn套

8、式PCR试剂盒(靶基因为Mpn 16S rRNA基因)、Cpn套式PCR试剂盒(以Campbell克隆的Cpn种特异的Pst1酶限制性片断为靶基因)及Mg DNA、Cpn DNA测序试剂均由无锡市克隆遗传技术研究所提供。Mg(G-37T)及Cpn(CWL-29)国际典型株，分别由首都儿科研究所细菌室郭章溉研究员和第三军医大学饶贤才老师提供(由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌研究员转赠)。三、方法1.咽试子标本采集：统一由临床医生用干棉签从患儿咽后壁旋转擦取(强调采集脱落细胞)，咽试子放入内含12 ml的生理盐水的洁净试管中立即送检。实验室获取标本后立即旋转洗净试子，弃试子，吸取500 l标本混液

9、置入0.5 ml离心管-20保存直至PCR检测。2.检测步骤：Mg、Mpn、Cpn套式PCR检测与Mg DNA、Cpn DNA测序，均完全按说明书操作完成。3.统计学处理：采取2和t检验。结果一、Mg、Mpn、Cpn套式PCR联合检测单项分析231例儿童呼吸道感染Mg、Mpn和Cpn三项病原体单项感染中，各种病原体与各种疾病之间差异均无显著性(P0.05)。肺炎、急性支气管炎中以Cpn感染率较高，与资料表明Cpn已成为肺炎的第3，4位常见病原体相吻合2(表1)。表1231例呼吸道感染患儿Mg、Mpn、Cpn套式PCR联合检测单项感染结果疾病谱例数感染例数(%)合计MgMpnCpn肺炎13429

10、(22)40(30)47(35)116(87)急性支气管炎3510(29)7(20)12(34)29(83)急性上呼吸道感染6213(21)24(39)17(27)54(87)合计23152(23)71(31)76(33)199(86)注：各种疾病中Mg与Mpn、Mg与Cpn、Mpn与Cpn之间经2检验P0.05二、Mg、Mpn、Cpn套式PCR联合检测组合分析231例儿童呼吸道感染Mg、Mpn和Cpn三种病原体混合感染中，各种疾病与各种病原体之间差异均无显著性(P0.05)，其中Mpn+Cpn感染率偏高(表2)。表2231例呼吸道感染患儿Mg、Mpn、Cpn套式PCR联合检测混合感染结果疾病

11、谱例数混合感染例数(%)合计Mg+MpnMg+CpnMpn+CpnMg+Mpn+Cpn肺炎1346(5)5(4)15(11)12(9)38(28)急性支气管炎352(6)1(3)3(9)2(6)8(23)急性上呼吸道感染624(6)0(0)7(11)6(10)17(27)合计23112(5)6(3)25(11)20(9)63(27)三、DNA测序结果分析2例Cpn套式PCR检测阳性标本，经DNA测序与Cpn(CWL-29)株序列完全相同。Mg(G-37T)株与常州2例Mg套式PCR检测阳性标本Mg DNA测序结果见1。MgG-37T CGTTATCCGG ATTTATGGGC GTAAAGCA

12、AGCGCAGGCGGA TTGAAAAGTC TGGTGTTAAA GGCAGCTGCTTAACAGTTGT ATGCATTGGA AACTATCAGT CTAGAGTGTGGTAGGGAGTT TTGGAATTTC ATGTGGAGCG；病例1 CGTTATCCGG ATTTATGGGC GTAAAGCAAGCGCAGGCGGA TTGAAAAGTC TGGTGTTAAA GGCAGCTGCTTAACAGTTGT ATGCATTGGA AACTATCAGT CTAGAGTGTGGTAGGGAGTT TTGGAATTTC ATGTGGAGCG；病例2 CGTTATCCGG ATTTATGGG

13、C GTAAAGCAAGCGCAGGCGGA TTGAAAAGTC TGGTGTTAAA GGCAGCCGCTTAACAGTTCT ATGCATTGGA AACTATCAGT CTAGAGTGTGGTAGGGAGTT TTGGAATTTC ATGTGGAGCG。 1Mg(G-37T)株与常州2例Mg套式PCR检则阳性标本Mg DNA测序结果讨论Mpn、Cpn是不典型肺炎综合征的主要病原体，已被人们所熟知。Mg是近年来从生殖道和成人呼吸道分离到的新的支原体3，4，被认为是非淋球菌性尿道炎和成人肺炎的潜在病原体。鉴于支原体、衣原体远较细菌培养困难，而套式PCR是近年较先进的分子生物学检测方法之一，

14、它不仅能检测到标本中单拷贝基因，而且第二轮扩增产物相当于对第一轮PCR产物进行验证，增强了特异性，因此较传统的PCR更为正确5，6。本组研究运用套式PCR技术，首次发现儿童呼吸道感染疾病中存在Mg感染，肺炎、急性支气管炎、急性上呼吸道感染Mg感染阳性率分别为21.6、28.6、21.0，同时存在Mg、Mpn、Cpn三项病原体的混合感染，Mg+Mpn、Mg+Cpn、Mpn+Cpn、Mg+Mpn+Cpn阳性率分别为5.2、2.6、10.8、8.7。与Baseman等5报道在16例Mpn培养阳性的标本中发现有4例存在Mg,以及De-Barbeyrac等4报道的从75例支气管肺泡灌洗液中用PCR法检测

15、，6例检出Mpn，4例检出Mg，3例两者均阳性的结果相符合。为确定套式PCR扩增到的产物，将Cpn、Mg各2例阳性标本与国际典型株相比较，结果2例Cpn、1例Mg的DNA序列与国际典型株完全一致，另1例Mg DNA序列与国际典型株相比有一个碱基突变，同源性也高达99.8。从而证明Mg可以在儿童呼吸道形成集落，并且可能是儿童呼吸道感染的病原体，Mg、Mpn、Cpn三项病原体存在混合感染。本组研究对存在支原体、衣原体单项感染或混合感染儿童均给予静脉或口服红霉素，临床上收到满意的效果。因此，在检测儿童呼吸道感染病原体时应该多项病原体同时检测，从而达到早期诊断、准确治疗的目的。作者单位：213003

16、常州，苏州医学院第三附属医院儿科参考文献1王慕逖，主编.儿科学.第4版.北京:人民卫生出版社,1996.245-247.2糜祖煌.肺炎衣原体的套式(Nested)PCR检测及其临床意义.中国优生与遗传杂志,1997,5:14-16.3Baseman JB, Dallo SF, Tully TG, et al. Isolation and characterization of mycoplasma genitalium strains from the human respiratory tract. J Clin Microbiol, 1988,26:2266-2269.4De-Barbeyrac B, Bernet-Poggi C, Febrer F,et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium in clinical samples by polymerase chain reaction. Clin Infect Dis,1993,17(suppl):83-89.5马鸿达,朱钧,张乃鑫,等.结核分支杆菌DNA的单管