大鼠肝脏缺血再灌注对胆小管纤维形肌动蛋白微丝的影响

1、大鼠肝脏缺血再灌注对胆小管纤维形肌动蛋白微丝的影响         11-01-09 10:20:00     编辑：studa20                  作者：黎一鸣，刘继东，吉鸿，李顺乐【摘要】  目的 探讨大鼠肝缺血再灌注(I/R)对胆小管纤维形肌动蛋白(Factin)微丝的影响。

2、方法 采用肝缺血35min再灌注模型，检测血清中ALT、AST、GGT和TBIL的含量；电镜观察胆小管的变化；异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽(FITCPhalloidin)显示胆小管Factin微丝的分布变化，激光共聚焦显微镜采集图像并定量分析。结果 Factin微丝荧光变化和电镜超微结构的改变相符合，Factin的荧光染色再灌注前正常，而再灌注后明显减弱；胆小管微绒毛再灌注前没有消失，而再灌注后却大量脱落。这与血清GGT和TBIL的异常改变一致。结论 再灌注而非缺血可造成胆小管Factin微丝破坏、微绒毛丧失，导致胆小管收缩减弱，胆汁排泄功能受损。这可能是大鼠肝I/R后胆汁淤积发生的主要机制。

3、 【关键词】  肝缺血再灌注；胆汁淤积；纤维形肌动蛋白F    ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of hepatic ischemiareperfusion(I/R)on bile canalicular Factin microfilaments in rat. Methods  A model of rat hepatic ischemiareperfusion was adopted and the ischemia time was 35min. The level

4、s of serum ALT, AST, GGT, and TBIL were measured. The changes of bile canaliculus were observed by transmission electron microscope. The modification of Factin microfilaments was quantified by using FITCPhalloidin and analyzed by confocal laser scanning microscopy imaging. Results  This modific

5、ation of Factin staining was consistent with the observation by transmission electron microscopy. The staining of Factin was normal in hepatocytes before reperfusion, but decreased significantly after reperfusion, and there was a marked loss of canalicular microvilli after reperfusion, which were in

6、 coincidence with abnormality of serum GGT and TBIL. Conclusion  Reperfusion not ischemia induced disruption of Factin microfilaments and a loss of microvilli, and these modifications could lead to impaired bile excretion by damaging canalicular contraction, which maybe the main mechanism of ch

7、olestasis after rat hepatic ischemiareperfusion.    KEY WORDS: hepatic ischemia reperfusion; cholestasis; Factin   肝脏缺血再灌注后常有胆汁淤积的发生13，其机制尚未完全了解。Factin微丝沿质膜分布，尤其在胆小管区域，它对胆小管收缩引起胆汁排泄起重要作用4。目前，国内尚无对肝缺血再灌注时胆小管Factin微丝变化的研究报道。本实验通过异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽显示大鼠肝脏胆小管Factin微丝在经历缺血再灌注后的变化，用激光共

8、聚焦显微镜采集图像并定量分析，以期探讨上述胆汁淤积发生的机制。    1  材料与方法    1.1  材料  雄性SD大鼠36只，体重200250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽(FITCPhalloidin)和抗荧光衰减封片剂均购自Alexis公司。日立HITACHI公司H600透射式电子显微镜由西安交通大学医学院电子显微镜中心提供。激光共聚焦显微镜(型号：TCS Sp2)由西安交通大学医学院中心实验室提供。    1.2 

9、 实验分组  36只大鼠随机分成6组，每组6只。对照组：术中只开腹解剖肝门，不做肝门阻断及再灌注，直接取材。 缺血组：肝门阻断35min，不做再灌注。I/R 2h组：肝门阻断35min，再灌注2h。I/R 6h组：肝门阻断35min，再灌注6h。 I/R 24h组：肝门阻断35min，再灌注24h。I/R 48h组：肝门阻断35min，再灌注48h。    1.3  动物模型及取材  大鼠术前12h禁食，自由饮水。戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，取上腹正中切口入腹，游离肝蒂，用无创血管夹夹闭，造成100%实质性肝缺血，持续时

10、间为35min，后去除血管夹，形成再灌注。至预定时点取材，心腔采血，制备血清。迅速切取肝脏组织，部分低温下细切为1mm3大小，20g/L戊二醛固定，备电镜标本；部分用冰生理盐水洗去血迹、拭干，快速置入冻存管，于液氮罐冷冻后移入-80冰箱保存，待Factin检测；部分置100mL/L甲醛保存。    1.4  血清学指标的测定  主要检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酰转肽酶(glutamyl tran

11、sferase, GGT)和总胆红素(total bilirubin, TBIL)。其步骤为：心腔采血，常温下凝固后离心，取血清送本院检验科，用7600型全自动生化分析仪测定。    1.5  病理学检查  肝组织石蜡标本行HE染色，光镜下观察肝组织的病理改变，透射电镜观察胆小管超微结构的改变。    1.6  Factin的检测5  将-80冰箱保存的肝脏组织于低温切片机(-28)下切成8m厚的冰冻切片；PBS简单冲洗、晾干，用37g/L的多聚甲醛于室温下固定10min，PBS洗3次；以下步骤

12、避光操作：滴加FITCPhalloidin染色液(甲醇溶解，PBS稀释至10mg/L)，室温孵化1h，PBS冲洗3次，每次15min，洗去多余荧光；抗荧光衰减封片剂封片；于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，测定胆小管膜平均特异的荧光强度。    1.7  统计学处理  实验数据采用均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件处理，各组间比较用方差分析、Dunnettt检验，组间方差不齐时采用非参数秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。   2  结    果

13、0;   2.1  各组血清ALT、AST、GGT和TBIL水平的变化  ALT、AST水平与对照组相比，其他各组均显著升高(P<0.05)，并以再灌注6h组为最；GGT和TBIL水平与对照组相比，再灌注各组显著升高(P<0.05)，各组间呈逐渐升高趋势(表1)。表1  血清ALT、AST、GGT和TBIL水平的变化    2.2  光镜下肝组织病理学的改变  对照组肝组织形态无明显变化，为正常形态学表现。再灌注后各组肝组织轻度炎性反应，以再灌注后6h为甚，肝细胞胞质疏松、气球样变，

14、少许肝细胞坏死(图略)。    2.3  透射电镜下各组胆小管的改变  电镜下可见对照组正常大鼠胆小管横切面的形态外观，管腔面微绒毛丰富，肌动蛋白微丝形成的微绒毛核心清晰可见；胆小管周围的肝细胞膜形成紧密连接、桥粒等连接复合体封闭胆小管(图1A)；缺血35min后，可见胆小管腔面微绒毛依然存在，但微绒毛肿胀、模糊(图1B)；再灌注2、6、24h及48h后，胆小管形态明显改变，管腔扩张，腔面微绒毛脱落殆尽，偶见紧密连接增宽，腔内淤胆(图1C、1D)。     11-01-09 10:20:00  

15、   编辑：studa20    2.4  Factin的分布变化  对照组可见Factin的荧光染色沿肝细胞基底膜和胆小管膜分布，Factin在胆小管横切面呈明亮的小点状荧光(图2A)；缺血组中Factin的荧光染色和对照组相似(图2B)；再灌注2、6、24、48h后Factin的染色明显减弱，可见肝细胞基底膜的荧光紊乱，胆小管膜的荧光也大大减弱(图2C、2D)。    2.5  胆小管膜Factin的定量分析  胆小管膜的平均荧光强度，在缺血组和对照组之间无显著

16、性差异(P>0.05)；再灌注248h后，各组和对照组相比均有显著性差异(P<0.05，图3)。3  讨    论    纤维形肌动蛋白(Factin)是由单体球形肌动蛋白(Gactin)依赖ATP装配而成的，是细胞骨架结构的主要组成部分。TSUKADA等6发现胆小管微绒毛包含有许多Factin微丝束。这些微丝从质膜延伸至管腔共同构成胆小管微绒毛的内芯。胆小管是胆汁排泄的最小管道,它在胆汁分泌过程中起着重要作用6。胆汁在肝内的排泄依赖于胆小管的收缩。而位于汇管区周围的胆小管连续、有力、单向的收缩运动，可有效地将胆

17、汁推向肝门部的胆管。研究表明，Factin微丝连续地聚合与解聚作用实现胆小管的收缩，进而促进胆汁排泄7。业已证明，改变Factin微丝结构，将破坏胆小管收缩，从而导致胆汁淤积8。各种肝门阻断手术、休克、肝移植术后早期常出现胆汁淤积1,3。有国外学者报道此时肝细胞对胆汁的分泌功能并无显著变化23。因此，从临床角度出发，了解Factin微丝异常变化对肝缺血再灌注后胆汁淤积的发生机制具有重要的理论意义。    从本实验可见，血清ALT和AST水平，于再灌注6h达最高，随后下降；与此相反，血清GGT和TBIL水平各组间呈持续升高趋势。这说明肝脏经历轻度热缺血再灌注损伤后，

18、肝细胞发生可逆性损伤，并出现胆汁淤积；随着受损肝细胞的逐渐恢复，胆汁淤积仍然存在。文献报道，原位肝移植术后，血清ALT和AST水平很快达到高峰，随后便迅速下降；而血清GGT和TBIL水平却持续上升，两周左右才达到高峰1,3。这也说明肝脏经历缺血再灌注后一定时期内存在胆汁淤积。同时，本实验的肝组织病理学检查也证实，大鼠全肝缺血35min再灌注模型炎症反应较轻，仅有少许肝细胞坏死，这样就避免了因肝细胞大量坏死造成的胆汁淤积和对Factin的潜在影响。    我们的实验结果显示：荧光变化和电镜超微结构改变相符，再灌注248h，Factin荧光染色紊乱、减弱，强度明显低于

19、对照组；胆小管微绒毛大量脱落。热缺血35min后，Factin荧光染色与对照组比较无明显变化，胆小管微绒毛没有消失。以上结果与再灌注后血清GGT和TBIL的异常改变相一致。这充分说明：鼠肝缺血再灌注后Factin微丝破坏、细胞骨架崩解导致胆小管收缩功能受损，胆汁排泄障碍，从而导致胆汁淤积；胆小管Factin微丝对再灌注损伤非常敏感，而对单纯的短期(35min)热缺血反应不敏感。BENKOEL等5发现，肝移植术后再灌注早期，胆小管膜Factin的荧光染色与对照组相比减少了25%，而在冷缺血末期，Factin的荧光染色与对照组相似；CUTRIN等1证实肝移植术后再灌注早期胆小管微绒毛大量丧失，其改

20、变与经细胞松弛素B灌注后的肝脏胆小管、微绒毛相似，冷缺血末期胆小管内微绒毛无显著变化。这与我们的实验结果相似。    Factin微丝于再灌注之后的这种改变可能是活性氧(ROS)对其破坏的结果。肝脏缺血再灌注早期即产生大量活性氧7。离体大鼠肝细胞的实验研究证实，活性氧能导致肌动蛋白细胞骨架的重排，但这种损伤性改变可能是由钙离子依赖性PKC所介导的，而非直接的氧化作用，氧化应激导致钙离子浓度增高并激活钙离子依赖性PKC介导Factin解体9。此外，Factin微丝的破坏可能也和钙平衡改变、ATP消耗有关。肝脏缺血再灌注损伤，使细胞内外钙的动态平衡紊乱，细胞发生钙超载

21、，激活细胞内磷脂酶C和磷脂酶A2、Ca2+依赖性蛋白酶等，从而破坏肌动蛋白细胞骨架。而线粒体内钙超载时，钙与磷酸根结合为不溶的磷酸钙，使呼吸功能受损，引起能量代谢障碍，ATP生产减少。同时，钙可激活某些ATP酶，加速ATP消耗。这样，ATP的耗竭使Factin断裂从而引起细胞骨架的破坏，微绒毛消失10。在我们的实验中，激光共聚焦显微镜和电镜均能观测到胆小管的这种变化。    此外，GUTMAYER等11报道，肌动蛋白细胞骨架对质膜抗高浓度胆盐的破坏起非常重要的作用。胆汁淤积使胆盐浓度升高，由于细胞骨架的破坏可能促进胆盐对胆小管膜的损伤，进一步加重了胆汁淤积。

22、60;   值得一提的是：肝脏短期的热缺血(如本实验35min)，虽然存在氧化应激，但其程度轻微，不足以造成损伤12。另外，肝细胞在缺血期间，钙离子浓度几乎没有变化，但再灌注时，钙离子浓度急剧增高。这可能是缺血35min时Factin微丝变化不显著的原因。FUKAI等12在大鼠部分(70%)肝脏缺血再灌注实验中发现，热缺血期间发生的氧化应激，其程度将随缺血时间的延长而加重。因此，我们推测，延长热缺血时间，Factin微丝于缺血期间可能也会发生变化。这就提示我们，在实施肝脏移植、肝脏部分切除等手术时，尽量缩短肝脏的热缺血时间，减少氧化应激对Factin微丝的损伤，从而减轻术后可能出现的胆汁淤积。    大鼠缺血35min再灌注模型所致的胆汁淤积是可逆的2。由于实验时间限制，我们不能确定受损Factin微丝、微绒毛及胆小管的形态学及功能水平的恢复情况以及对胆汁排泄的远期影响，还有待进一步地研究。【参考文献】  1CUTRIN JC, CANTINO D, BIASI F, et al. Reperfusion damage to the bile canaliculi in transplanted human liver J. Hepatology, 1