WB灰度值测定

1、Image J关丁用 Image J 重化 wester法，然鹅小伙伴们却一直不确定到底 光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机, 灰度值？以下是两种方法的具体操作。方率-:1、打开Image J 软件一左带摆正）2、把图片转化成灰度图片：3、A个矩形工具一选上所有条带测到了 WB条带灰度俏nblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方那种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与会学习卜，请先看看你是用以下那种方法测量:上角 file Open 选择自己的条带图片（事先把条Image ftype - 8-bit（_L O U D _ 4、A A Q | 二/ 。，7 一 ：一 口DO口o4、 ana

2、lyze fGels f select fir开选取，如：框选 A个条带一z到余下条带一 Gelsfselect nextlan5、选中直线工具，将开口波峰关st lane f Gels - plot lanes（在这第四步也可以分analyze Gels 一 select firstlane 一将令-个框拖移e ）用1 u二4一+、1 A J d ，i <2<|/ 乔赞Fffl d 匚*一 1 人后口7 L-A KIlAP1 口Ajj 4.-J I IfIjJIrTi.工!1匕；V-I6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。方法1、打开Image J软件一

3、左上角file 一Open选择自己的条带图片（事先条带弄正）2、把图片转化成灰度图片：Image type - 8-bit3、扣除背景：Process Subtract Background - 50pixels 并勾选 LightBackground5、设定参数：Analyze fset measurement 勾选 Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density6、Analyze fset scale funit of length选项里改为pixels ,确定 Set ScwleDistance in pi

4、xels: 300Known distance： 1.0。Pixel aspect ratio: 1.0Unit of length: inchClick to Remove Scale GlobalScale: 300 ptxels/inchMHelp Cancel OK ）（心灵手6、图像分割。Edit - Invert 一选中椭圆圈（手残党首选）/不规则圆圈巧党义无反顾），手动圈上单个条带7、Analyze fMeasurement 即得到Intden,重复 6、7步就得到所有Intden 值RusultsAre Mein 网in lntD»n RawlctDenI 0.009

5、- 73.790 13135 0.641577Q4小伙伴们，你们是哪种方法呢？首先先把结论说出来，其实两者得出的Intden 严格来说都不是灰度值，前者是面积而后者是光密度值，但用来量化area 和WB条带都是OK的。Image J 这个软件在将western blot条带量化时存在两种参数：灰度与光密度（假，暂且这么称呼，原因下文再说），这两者在理解使用Image J量化 WB条带十分重要，请务必仔细看以下几个概念。1、灰度（gray）:是指图像中各种颜色的深浅程度，它以整数值表示，一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为0-255 共256级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小物体

6、颜色越深。有兴趣的小伙伴，可以随意用Image J打开一张图片，光标在图片上任意移动，得到的 value值最小为0 （纯黑），最大为 255 （纯 白）。imageJ2.53 (760), y = 1.22 (365), value=0七| A C | /value-2SS。0E309D2、光密度（OD ,真）：也就是吸光度（ A）,光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数 OD=lg （Io/Ib ）,其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。入射光ToQ出射光Tb*明确这两个概念后，我们再来看为什么称Image J里的光密度是“假”，因为

7、在图像分析中的光密度（假）是由灰度值再经计算得到的，它是一个相对值，但其算法与OD值的算法类似。只是它白入射光强度由Western blot胶片上最亮区域的平均灰度值代替，而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。即：图像分析系统的光密度值=lg（WB 胶片上最亮区域的平均灰度值/待测目标的平均灰度值），再简单点来说，就是光密度（假）和正儿八经的灰度值有血缘关系。总结起来说灰度与光密度（假）都能用来量化western blot条带，两种量化任君随意挑。现在说回两种操作方法：方法一：是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线，最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。条

8、带越大，area值越大。方法二：是通过上文说到的光密度（假）计算方法得出来的，最后得出的Intden 值是所圈面积下的总光密度值，再除以圈下面积area ,得出的是平均光密度值（图像中阳性区域每一像素点的OD值叠加后除以测量的面积）。条带（颜色反转后）越白越亮则Intden/area 越大。所以严格意义上来说，方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值，但又与灰度值有着千丝万缕的联系。如果只是量化WB条带，两种方法是都能选用的，记得标注你得到的结果是area还是Intden ，但如果你想测出真正的灰度值，那么我们下节课再来好好谈谈，咦？我说话怎么越来越像老师的风格呢，哈哈，同学们，下

9、课.今天主要讲述如何用photoshop 测量 WB灰度值，在讲述操作方法之余，小石头先给大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。照例最先展示下最后的成果图（其实最后可以用Graphpad 做图，在此不赘述）：=A2-C2AB.CDE加魔片（平均ten面板巧承灰J度包，施拙度被型冽依总灰魔45.&?62711770.026991|45.5492 斜8062 2226632.2G36622Q10.02C99132,236691G479,5746S1123 39239a410.026991123 36S399103750.3006131 A10S5712S6002699113

10、1.783966170792,019917 1D6S2314590.02G991170.07S93224B14S,6208163 620371S120.026991163 593379247353 189条帚忌萩度30CO0Q1SXJOOOkooo1(KKX)C5COOC好了，开始今天的课程，现在手里有张这样的WB条带图，如何将各条带灰度0值测量出来?首先我们从基本原理聊起，图片大小的存储基本单位是字节，每个字节是有8个比特（bit ,音译为比特，也称为“位”）组成。一般的图片都是由众多像素点构成的，灰度模式下一个像素一个字节，也同时就是 8bit。在上一堂课中，我们曾用ImageJ将图片转化

11、为灰度图，就是通过image - type - 8-bit这一步。如果把黑-灰-白连续变化的灰度值量化为256个灰度级，灰度值的范围也就为0-255 ,表示亮度由深到浅。G57414S1 5014G从上图我们可以得知纯黑为0,纯白为255,中间0-255代表各个不同亮度等级。而通常我们所得到的WB图片是这样的:r _ 前者A是没有转化为灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的话，显然有明显条带的的灰度数据基本都与0相近，数值很小,这样不利于互相比较。所以通常的做法是进行“反相”，也就是将白的地方变为黑，黑的地方变为白，颜色颠倒。也就是这样：照片底片，记不记得底片上人

12、物的头发都是白的发亮，这种就是灰度值255哦；还有做电泳凝胶的小伙伴，得到的凝胶图就不需要反相了，可以直接进行灰度值分析哦）。我们目前要想测量条带的灰度值，就只需把那发光发亮的地方圈出来，读取灰度值就可以了，而这一部分就交给photoshop来计算吧。在这里小石头想敲敲黑板，提醒大家注意下三点：1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比较 WB条带灰度值时，我们还应考虑面积的关系，以面积与平均灰度相乘得出的总灰度，我们才能更准确地得出条带之间的表达差异。2、条带上得出的数据其实是相对于背景而言的，这个背景虽然反相之后非常黑了，但毕竟不是全黑的，我们还需要扣除背景的灰度值。并且，

13、背景尽量干净，这就要求我们在做 WB时多努力了。3、不同图片的背景是不一样的，不同图片的 WB条带是不能进行相互比较的哦。接下来附上 Photoshop 测量 WB条带的灰度值的操作方法，其中每一步的意义基本已在上文所介绍，对哪一步操作有不明白的小伙伴可以回过头再看看的。步骤1 :打开软件 Photoshop一左上角打开图片步骤2:将图片转为灰度模式（如果已经为灰度，此步跳过）：图像一模式一灰度一扔掉步骤3:将条带摆正（两种方法）通用步骤：最左侧选取标尺工具一在条带上画一条自认本应水平的线d限M工X30科叵眩售工月金灯酥色H5?择器工与HTWW 尺工工G注神工具心？计蝴工具方法一：直接点击正上

14、方“拉直图层”（此操作简便，但有可能使边缘条带挪出 界外）Adobe Photoshop CC 2017 t比例拉亶图层清除X img014.tif 50%（灰色/8） *方法二：图像一图像旋转一任意角度一确定步骤4:得到的灰度图进行适当调整：图像一调整一色阶一调整下图中三个点，适当将自己的 WB图片转成黑白对比稍明显的样子，如图（此步也可通过更改亮度/对比度实现：图像一调整一亮度 /对比度）步骤5:反相：图像一调整一反相步骤6:最左侧多边形套索工具一延条带边缘圈选一图像一分析一记录测量析一选择数据点可以只显灰度值-平均值和面积），依此步依次测量各个条带，同样 的方法选取任意一个背景测量背景灰度值。步骤7:导出数据，进行处理IlliZJ5r 3 门AaGDf半加酊用 MH超魔'宝丽而*4aS7V2711 ?f 4口26»0丈 _ _ 巴垄蛔里ij,aKUZ2»£01 CD3WI4I- -ni?MT/，TdUH<lI及皿编4H3 e 口加他11益融通1O37