NF-kb信号通路

1、NF-KB与微循环障碍核因子-KB(nuclear factor-kappa B,NF-KB蛋白家族是一种多效性的转录因子,可以与多种基启动子部位的KB位点发生特异性的结合从而促进其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖,细胞因子等多种刺激而活化后,能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。而这些刺激因素及其调控的因子与微循环障碍的发生、发展均有着密切的关系。本文就NF-KB的组成结构,活化调节及与微循环障碍的关系等方面做一综述,以期从一新的角度阐述微循环障碍发生的机制及改善的途径。1.NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构1986年,Sen 等首次从鼠B

2、淋巴细胞核提取物中,发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC特异结合,调节其基因表达的核蛋白因子,称之为NF-KB。随后大量的研究又陆续发现了NF-KB家族的其它成员,其构成亚基分别是NF-KB1 (P50、NF-KB2(P52、P65(RelA、c-Rel(Rel、RelB等,因这些亚基的N-末端均崐有约300个氨基酸残基的Rel同源区(rel homology domain ,RHD,故统称为NF-KB/Rel蛋白家族。其RHD内含DNA结合区,二聚体化区和核定位序列,分别具有与DNA KB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-KB抑制蛋白(IKB家族成

3、员相互作用并携带核定位信号(NLS,参与活化的NF-KB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。又根据结构、功能和合成方式的不同,Rel蛋白分为两类。一类为P50(NF-KB1和P52(NF-KB2,分别由含有C-末端锚蛋白重复序列(ahkrin repeat motif的前体蛋白p105和p100通过ATP依赖蛋白水解过程裂解而形成。该类蛋白含有RHD,但缺乏转录活性区,无独立激活基因转录的功能。另一类为p65(RelA,Rel(c-Rel,Rel B和果蝇的dorsal、Dif和Relish,它们没有前体,除N端的RHD外,其C-端有一个或多个转录活性区,具有直接作用转录设备而激活基因转录的功能

4、。Rel蛋白成员间可形成多种形式的同源或异源二聚体,如p50/RelA、p50/p50、RelA/Rel 等,但并不是都可构成二聚体,如RelB只能与p50或p52二聚体化,而不能构成同源二聚体。Rel间的二聚化作用是其与DNA结合的特性所决定的,因为KB位点为二元对称结构,二聚体中的每一成员只与半个识别序列发生作用。而且不同的NF-KB/Rel蛋白二聚体具有不同的结合序列(KB位点,因而具有各自的特性。如NF-KB的KB序列为十聚体的5'-GGGRNNYYCC-3',而p65/c-Rel二聚体的KB序列为十聚体的5'-HGGARNYYCC-3',(H代表A,C

5、或T,R代表嘌呤,Y代表嘧啶。这样保证了NF-KB/Rel家族对基因调控的特异性,这种特异性还与细胞类型、亚细胞结构定位、相互作用的IKB类型及激活的方式等有关。通常所指的NF-KB的组成为p50/p65异源二聚体,其几乎存在于体内所有细胞,且含量常常最高。除RHD外,其组分p50有很少其它序列,而P65则有250个氨基酸残基的C-未端,内含2-3个独立的转录活性区,有增强靶基因转录激活的作用,而且p65的另一个重要功能是与IKB 成员直接偶然。其他的同源或异源二聚体的核因子-KB在体内含量极少,但可能对某些特定的启动子有独特和重要的作用。Lehming等报道存在于淋巴细胞中p50同源二聚体能

6、以结构型与DNA链KB序列结合,对转录起抑制作用。讫今为止的体内外实验发现NF-KB/Rel蛋白复合物大多以这样有二种类型存在于胞浆中:同源或异源二聚体与IKB蛋白家族构成的三聚体;Rel蛋白(如p65与未裂解的前体(如p105组成的二聚体。信号转导可诱导IKB和p105磷酸化而降解,从而使NF-KB活化再由胞浆转核而发挥效应。1.2 IBK家族IKB蛋白家族成员有IKB(MAD-3,pp40、IKB、IKB/p105、IKB/p100、IKB、Bcl-3以及果蝇属的Cactus等。其家族结构特点是均有多个约33个氨基酸的重复序列,称为崐SWI6/锚蛋白重复序列,主要参与与Rel蛋白的RHD相

7、互作用。IKB蛋白主要有以下三个部分构成:1.与蛋白降解有关的N-末端区;2.能与NF-KB相互作用的内部区(区内含有锚蛋白重复序列;3.称为PEST的C-端区,主要参与“囚禁”NF-KB在细胞浆中。1.2.1 IKB,IKB主要与含有p65和c-Rel的二聚体具有高亲和力,与其它Rel蛋白亲和力低,是体内NF-KB(p50-p65的主要调控抑制蛋白。IKB的基因启动子上有KB位点,故其合成也受到NF-KB的调控,因此形成对NF-KB的负反馈调节。IKB则无这种机制。这种调节差异可致NF-KB调控的靶基因的表达表现在时间上和水平上的差异。1.2.2 IKB, IKB作为p50和p52蛋白前体的

8、p105和p100,由于在结构上有能与RHD相互作用锚蛋白的重复序列,在功能上有类于NF-KB抑制剂的作用,因此将之归于IKB家族,称为p105/IKB,p100/IKB。例如:p105既含有在N-未端区的p50,又含有3-4个锚蛋白重复序列的C-未端区,因而它既能掩蔽p65、c-Rel,又可以通过蛋白水解释放出p50。1.2.3 IKB,Bcl-3 IKB主要与p65发生抑制作用,专一性地与p65和c-Rel结合,与IKB 具有多方面的共同特性。Bcl-3位于胞核,虽然表现出能抑制含有p50的二聚体,但与p52在DNA上结合后却发挥了转录共激活的功能。1.3 NF-KB的活化信号转导途径非活

9、化状态的NF-KB以与IKB聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体的形式存在于细胞浆中,在多种因素的刺激作用下,通过多种信号转导途径使IKB磷酸化,再在蛋白水解酶作用下发生降解,从而使NF-KB得以活化而转核发挥其调控作用。这个过程大致分三部分: 1.3.1刺激因素的信号转导:多种因素如细胞因子(TNF-、IL-1、IL-2、病毒(流感病毒、鼻病毒、双链ANA、氧化剂、细菌脂多糖、多种抗原及紫外线照射等均是NF-KB活化的刺激信号,能通过多种不同的信号转导途径,由胞外向胞内传递,使NIK(NF-KB-inducing kinase或活化途径中的其它激酶激活,而致NF-KB的活化。Cao等提出

10、IL-1的活化途径是:IL-1与胞膜上的IL-1受体(IL-1R识别结合后,IL-1R胞浆内组份立即与IL-1R辅助蛋白(IL-1R accessory protein,IL-RAcP联结,IL-1RAcP再聚集活化一种接合体蛋白髓细胞样分化蛋白(Myeloid differentiation protein MyD88,MyD88再聚集两种丝氨酸/苏氨酸激酶:IL-1受体活化激酶(IL-1 receptor-activated kinase IRAK和IRAK2而共同形成受体复合体。IRAK、IRAK2又随后又跟一种接合体分子TNF受体结合因子6(TNF receptor-associate

11、d factor 6,TRAF6相互作用。TRAF-6使IRKA、IRAK2与NF-KB诱导激酶(NF-KB-inducing kinase NIK相联结,NIK被激活。zhang等则通过实验证明,LPS与其受体结合后要通过IL-1的浆内信号介导途径激活NIK.从而活化NF-KB的。而Takeuchi等揭示TNF激活NIK是通过TNF受体、TNF受体结合死亡区(TNF reeeptor associated death domain,TRADD、TRAF2及丝氨酸/苏氨酸激酶RIP的过程。双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA和佛波酯(PMA则分别通过dsDNA依赖的蛋

12、白激酶(dsDNA-dependentprotein kinase, PKR和PKC、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK-PP90rsk来使IKB磷酸化。1.3.2 IKB的磷酸化及降解NIK属于丝裂原激活蛋白激酶MAPKKK家族的。NIK活化IKB激酶复合体IKK、IKK , IKK、IKK催化IKB上Ser32/36磷酸化,然后IKB上Lys21/22遍在蛋白化(ubiquitination,再遍在蛋白连接酶(ubiquitin conjugation enzymes作用下与蛋白酶小体(proteasome连接,在蛋白酶小体作用下IKB降解,NF-KB活化。1.3.3 NF-KB核转位及调控基因

13、表达。IKB降解后,暴露NF-KB上的核定位信号,NF-KB迅速发生转核,与调控基因启动子上的KB位点结合,启动基因转录。2.NF-KB在微循环障碍发生发展中的作用。NF-KB活化后能调控一系列基因的表达:如粘附分子家族的细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion nolecule-1,ICAM-1、血管细胞粘附分子-1(vascullar cell adhesion molecule-1,VCAM-1、E-选择素(E-selectin、p-选择素(P-selectin前炎症性细胞因子TNF-、IL-1、IL-2、IL-6,化学趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(Monocyt

14、e chemoattoactant protein-1,MCP-1、IL-8以及一些受体分子IL-2受体、T细胞受体、链,等等。而这些物质都能直接或间接地作用于微血管内皮细胞或血细胞或者介导它们之间的相互作用,从而导致微循环障碍。2.1 NF-KB介导的微管内皮细胞的损伤。2.1.1炎症性浸润引发的损伤已知ICAM-1基因启动子上有1个基本的NF-KB位点, VCAM-1基因有2个NF-KB位点,E-sel基因有3个NF-KB位点。在TNF、IL-1、LPS及活性氧作用下,能在30min内使NF-KB活化升高,并且持续很长时间,然后单独或与其它因子协同作用下,使ICAM-1、VCAM-1、E-

15、sel在2-4小时内表达增加,6-12小时内达到峰值,而且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖的方式。不同途径抑制NF-KB的活化或清除刺激来源后,均能相应地抑制这种活化和表达。ICAM-1、VCAM-1、E-sel能与白细胞表面的配体相应地结合,介导白细胞的贴壁粘附,致白细胞聚集、浸润,从而导致局部炎症的发生,微血管内皮细胞损伤,表现为微血管通透性增加、组织水肿等,微循环障碍发生。P-sel又名血小板活化依赖颗料表面膜蛋白(Platelet activation dependent granule-external membrane,PADGEM或GMP-140,参与介导内皮细胞与中性粒细胞

16、、单核细胞的粘附。研究表明在鼠P-sel基因启动子上-218GGGGGTGACCC(-207处有KB位点,TNF-、LPS刺激下,NF-KB与结合cAMP反应元件的核因子协同促进P-sel基因的表达,在2h时能检测到这种增高。NF-KB通过调控IL-8及MCP等化学趋化因子的表达,从而募集大量的单核巨噬细胞、中性粒细胞,引发炎症浸润和损伤。Ping等认为在LPS、TNF-促进MCP的表达中,p65是必需的Rel家族蛋白,而Stylianon则指出Mcp上的两个KB位点A1和A2中c-Rel只与A2结合,而且在IL-1刺激MCP表达过程中,出现c-Rel-p65和(p652选择性反式作用于A1、

17、A2位点的现象。NF-KB还能促进IL-2受体,T细胞受体、链的表达,从而介导了IL-2的毒性损伤以及T细胞与内皮细胞粘附,导致内皮细胞受损。2.1.2 NF-KB活化后促内皮细胞的凋亡,致微血管损伤。NF-KB的活化能诱导内皮细胞的凋亡,主要有以下几种方面的证据:在许多促调亡基因: C-myc、TNF及IL-1转化酶(IL-1 converting enzyme,ICE启动子上都发现了KB位点。TNF-诱导凋亡中出现了NF-KB的伴随活化。胸腺细胞能活化NF-KB而诱导细胞凋亡。通过清除NF-KB的诱导物活性氧(reactive oxygen species,ROS能抑制凋亡的发生。也有研究

18、表明在恶性肿瘤,变态反应和自身免疫疾病中,NF-KB通过上调凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP而抑制瘤细胞等的凋亡,从而加重了疾病的发生,这可能与Rel 家族不同成分及不同的刺激、信号途径有关。2.2 NF-KB活化影响凝溶的平动态衡,促微血栓形成。2.2.1 NF-KB活化促进vWF(von Willebrand Factor的表达。vWF是因子的相关因子,它与因子结合,能有效防止在血浆中迅速降解。VWF与结合,组成F/VWF,一端与血小板糖蛋白Ib结合,另一端与内皮细胞下的胶原纤维连接,介导血小板粘附血管内皮,促进微血栓形成。Keightley报道p50能与

19、VWF启动子结合,从而影响血液中vWF水平。镰刀型贫血病时高水平的vWF介导镰刀型RBC的聚集及与内皮细胞的粘附,并且促进血小板内皮细胞粘分子(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1的磷酸化,抑制NF-KB则明显改善这些指标。2.2.2 NF-KB调控内皮细胞合成组织因子(Tissue factor,这是一种亲脂性蛋白能作为受体与因子和a结合而形成复合物,使IX和X裂解,从而既激活外凝系统又激活内凝系统。IL-1、LPS、TNF均能通过刺激NF-KB促进其的合成,在2h达到峰值,且存在时间,剂量依赖性,已在内毒素血症DIC的发

20、生发展中得到证实。2.2.3 NF-KB对纤溶的影响纤溶与抗纤溶在正常情况下维持动态平衡。但纤溶酶原激活抑制物-2(Plasminogen activator inhibitor type-2,PAI-2启动子上有两个KB位点。TNF-能刺激NF-KB 促PAI-2的表达。Dechend也报道动脉粥样硬化时内皮细胞产生的PAI、组织因子等促凝血蛋白质的升高伴随着NF-KB的活化。而p65的持续活化则能促进uPA(urokinase-type PA的表达,因为uPA启动子上也发现了一个KB位点。NF-KB的活化能紊乱微血管的纤溶系统。2.3 NF-KB在微循环障碍中的自我调控2.3.1 NF-K

21、B经细胞外的正反馈调节:NF-KB活化后,可增强TNF、IL-1、IL-2的基因转录,TNF-、IL-1、IL-2产生和释放增多,进而再次激活NF-KB;同时还可使IL-6、IL-8等这些前炎症因子产生、释放增多,从而导致最初的炎症信号进一步放大,加重机体损伤及微循环障碍,直至DIC或死亡。这种情况多见于脓毒综合征(sepsis syndrome和急性呼吸窘迫综合征(ARDS等。但通常这种情况在机体内不是这样无止境无限制的,因为NF-KB有负反馈调节。2.3.2 NF-KB经细胞内、外的负反馈调节:在胞内NF-KB活化后除启动炎症介质基因转录外,同时还上调IKB、Bcl-3以及具有双重功能的p

22、100、p105前体蛋白,这些新增加抑制蛋白,能迅速在核内或核外重新灭活活化的NF-KB。从而终止炎症介质的转录,限制急性炎症反应。其中IKB的效果最明显,NF-KB在活化后30min就有了IKB的合成,因而单纯刺激IKB的磷酸化只能引起短时相的NF-KB的活化。IKB的合成不受NF-KB的调控,因此IKB磷酸化能引起NF-KB长时相的活化。故若缺乏IKB,则易引起广泛的全身性炎症。此外NF-KB的活化也使p50同源二聚体生成增多,此种二聚体不能被IKB有效结合,并缺乏转录激活区。易位至细胞核后,可与NF-KB竞争性结合KB序列,抑制NF-KB的活性。在细胞外,LPS、TNF-和IL-1能刺激

23、反向调节细胞因子IL-10的产生,IL-10能阻止单核细胞中内毒素诱导的NF-KB的活化,从而限制急性炎症反应,缓解微循环障碍。NF-KB能促进Mn SOD(manganese superoxide dismutase ,MnSOD及iNOS(inducing nitric oxide synthase,iNOS的表达。MnSOD启动子上有KB位点,LPS、ROS刺激下,NF-KB和C/EBP、NF-1等共同作用,促进MnSOD的表达,从而清除自由基,抑制NF-KB活化,减少自由基的损伤作用。蛋白酶抑制剂MG341、TLCK能抑制IL-1诱导的iNOS的升高,通过抑制IKB 的降解过程。展望:

24、微循环障碍广泛发生于临床各种疾病、创伤及某些生理应激情况下,其发生不仅是局部或全身组织器官的损伤的标志,而且持续的微循环障碍更加重了疾病的发生、发展及预后。因此通过抑制NF-KB的激活,从而阻断NF-KB调控的炎症反应,缓解微循环障碍,减轻机体组织的损伤,正日益成为研究的热点。当前实验研究从基因治疗、蛋白激酶抑制、免疫抑制及抗氧化几个途径着手来抑制IKB的降解或直接抑制NF-KB的活性,已经取得了一定的突破,并且对糖皮质激素、阿司林、Vc、Ve等的抗炎症、抗氧化损伤机制提出了新的药理认识,指导了临床应用。相信将来能更尽一步弄清NF-KB的活化及调控机制,从而能够实施针对性、特异性治疗。NF-k

25、b探针5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-33-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5NF-B一般以同源或异源二聚体形式存在,激活后与靶基因上特定的DNA序列(B位点,其核心序列为GGGRNNYYCC,R:嘌呤Y:嘧啶N:任意碱基结合并调节基因转录。只要有这段核心序列就行,无种属差异。NF-B-类风湿关节炎的治疗靶标前言:类风湿关节炎(RA是世界性疾病,在我国也是一种常见病,患病率约为0.3%。这种系统性慢性炎症性疾病是一种复杂的自身免疫病,目前公认的RA是由不明抗原介导免疫的反应,导致自身抗体产生,RA以炎症细胞浸润滑膜及大量炎症介质产生,

26、非化脓性增生性滑膜炎为特点,逐渐导致关节软骨的破坏,最后造成关节功能的障碍,并可伴有关节周围软组织及其它器官的损害。核转录因子NF-kB是一种多极性基因调控蛋白,能调节多种参与免疫反应的细胞因子、炎症介质、粘附分子、及蛋白酶类的基因转录过程,从而控制它们的生物合成。NF-kB能够参与免疫细胞的分化,增殖,和活化。NF-kB在参与某些细胞的生长调控以及抗细胞凋亡方面亦起着重要的作用,因此NF-kB在RA发病的多个环节中起重要作用,所以,抑制NF-kB活性为临床治疗各种RA提供了一条新的治疗性干预途径,同时也为筛选新型治疗RA的药物指明了前进方向。一NF-kB系统的组成1. NF-kB系统的组成N

27、F-kB系统几乎存在于所有细胞中,由NF-kB家族及其抑制物I-kB家族共同组成1。NF-kB家族由Rel蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体的形式存在。在哺乳动物细胞中有五种NF-kB /Rel家族成员:RelA(P65, RelB,C-Rel,NF-kB 1(p50,NF-kB 2(p52。每个家族成员含有一个由N-端300个氨基酸组成的保守的Rel同源结构域(RHD负责DNA结合、二聚化、核定位及与I-kB抑制性亚单位相互作用,其中P65含有转录活化区域。尽管存在多种Rel家族成员,但习惯上通常把由多肽p65和p50两个蛋白亚基组成的同源或异源性二聚体称为NF-kB,其中异源性二聚体活性较

28、强,在NF-kB异源性二聚体中,虽然二种亚单位均能与DNA结合,但只有P65在蛋白的C末端含有转录激活区域,能直接作用于转录元件而激活转录过程2-3。静息时NF-kB二聚体与I-kB蛋白家族构成三聚体而存留于胞浆,当细胞受到外界因素,如细菌或病毒感染、炎症细胞因子、TNF、LPS、紫外线照射、电离辐射等刺激后,I-kB将发生磷酸化并迅速降解,NF-kB被释放,、激活并进入细胞核,结合于特异性DNA位点,从而启动一系列基因的转录,发挥其重要的生物学作用4。IB蛋白家族是NF-B的抑制物,目前已知包括I-kB、I-kB、I-kB/p105、I-kB、I-kB、Bcl-3、P100等成员。该家族成员

29、分子中均含有5-7个约含30个氨基酸的锚蛋白重复序列,这是I-kB与NF-kB相互作用的结构基础。I-kB通过非共价键掩盖NF-kB的核定位信号(NLS而阻止NF-kB的核转位。2.NF-B的激活过程主要分三步:1. NF-kB的诱导剂通过细胞膜激活胞浆中的IB激酶,使IB在32、36位丝氨酸的磷酸化,磷酸化的IB接着被lys21、lys22上被泛素化,泛素化的IB迅速被26S的蛋白酶体降解,NF-B游离于胞浆中;2. 胞浆内游离的NF-B移位至胞核内,与DNA分子靶基因中启动子区域的NF-B结合位点相结合;3. 启动靶基因转录,生成相应的mRNA。这一过程相当迅速,无需蛋白质合成。哺乳动物细

30、胞转染实验证明IK和IK是NF-B激活途径的关键酶。3.NF-B的激活剂与抑制剂目前发现多种因素可诱导NF-B活化。前炎性细胞因子,如TNF、IL-1;与细胞分裂、增殖有关的因素,如抗原、植物血凝素(PHA、刀豆素A(ConA和佛波酯(PMA;细菌毒性产物LPS、病毒、双链RNA等;物理化学因子,如紫外线、吐根碱、放线菌酮等;致凋亡因子,如离子射线、化疗药物。在众多因素中活性氧产物在介导NF-B活化中可能起重要作用。NF-B的激活也能被多种因素抑制。5-6 免疫抑制剂,如糖皮质激素、环胞素、水杨酸、阿斯匹林;抗炎症因子,如IL-1、IL-10;抗氧化剂,如乙酰化胱氨酸、花生四烯酸、吡硌烷双硫脲

31、、倍半萜内酯;其他,如木霉素、cAMP、IK、NO、A20。植物药物是开发NF-B抑制剂的宝库,有人研究了通过NF-B信号转导通路发挥抗炎作用的药用植物,发现余甘子、蒙自桦、当归藤、扁担藤、独子藤、香须树生药的提取物可以抑制NF-B向核内易位。7有人也发现银杏8、姜黄素等多种天然植物药物可以抑制NF-B活性9。二NF-B的生物学功能1.NF-B参与调节的基因受NF-B调节的基因包括细胞因子与生长因子,如IL-2、3、6、8、12、IL-1、TNF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、EPO等;免疫受体,如免疫球蛋白轻链、T细胞受体、链MHC-I、II、2微球蛋白等;粘附分子,如细胞间粘附分子

32、1、血管细胞粘附分子1、内皮细胞白细胞间粘附分子等;急性期蛋白,如血管紧张肽酶、补体因子C4、补体因子B等;转录因子及调节子,如C-Rel、P105、IB、A20等;炎症酶,如诱导型一氧化氮合成酶、诱导型环加氧酶、胞质磷脂酶等;病毒,如HIV 1、HIV-2、CMV、ADV、SV-40等;其他,如穿孔素、波形纤维蛋白、核心蛋白聚糖。反过来,由NF-B调节的产物,如TNF和IL-1又能激活NF-B。这意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。NF-B并不是调节这些炎症和免疫基因的唯一转录因子,但它与其他转录因子如活化蛋白-1(AP-1共同起着中心调节作用10-12。2.NF-B与淋巴细

33、胞NF-B能够参与免疫细胞的分化,增殖和活化NF-B能够参与免疫细胞的分化,增殖和活化13-16,B细胞的生长发育受免疫球蛋白基因的有序调控,而NF-B在B细胞中的一个重要作用就是调节免疫球蛋白链基因表达,前B细胞一般不表达活化的NF-B,只有其发生分化时才能表达活化的NF-B 17 。成熟的B细胞系大部分以P50-C-Rel异源二聚体形式存在,而此二聚体与P50-RelA二聚体一样能有效地激活Ig基因的表达。利用“敲除”技术研究发现,在缺乏p50/p105亚基的小鼠,出现B细胞系的免疫反应缺陷,其B细胞在LPS刺激下产生抗体的能力明显下降18 。而在人类至今沿未见NF-B缺陷所导致的免疫功能

34、低下相关疾病的报道。NF-B在T细胞的增殖活化过程中亦发挥重要作用:对T细胞增殖最为关键的细胞因子IL-2及其受体a链的基因增强子上均有NF-B的结合位点,其表达直接受NF-B调控;在CD2/CD28协同刺激的T细胞中,NF-B特异性阻断PDTC,在阻断了NF-B活化的同时亦抑制了T细胞的增殖和有关因子的生成19-23 。.3.NF-B与细胞因子NF-B参与调控一系列重要免疫因子的表达(见前文,这此免疫因子对免疫细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着直接的调控作用。因此,NF-B在免疫系统在可能有着举足轻重的地位,是许多免疫炎症相关基因转录调控的枢纽,通过影响免疫细胞内NF-B的活性有可能

35、直接调控机体的免疫状态。4.NF-B与凋亡NF-B在参与某些细胞的生长调控有及抗细胞凋亡方面亦起着重要作用。自1996年A Ntwerp24发现NF-B能够抑制由TNF诱导的细胞凋亡有来,这方面的研究在不断深入,目前认为,NF-B主要通过以下三条途径来抑制细胞凋亡25-29,(1通过调控细胞因子而参与自身及其它细胞的凋亡;(2通过诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡;(3通过诱导TNF受体相关因子和凋亡抑制蛋白抑制凋亡。三NF-B与RA炎症,增殖及组织破坏1 .RA患者的主要免疫学异常1.体液免疫: RA患者体液免疫处于激活状态,表现在关节腔中出现大量浆细胞,外周血中CD5+B细胞(B1比例明显增高。

36、激活的B细胞可产生包括RF在内的多种自身抗体。自身抗体参与RA发生的可能机制是:自身抗体与自身抗原结合为复合物,激活补体和激肽系统,并刺激炎性细胞因子产生,从而导致组织损伤。2.细胞免疫:一般认为RA的发生和演变由尚未明确的抗原性肽类激活的T细胞所介导。RA关节滑膜中浸润大量T细胞,约占滑膜细胞的20%-50%,其中以CD4+T细胞为主。激活的T细胞可产生IL-2、IL-4、IFN-、LT等细胞因子,参与RA病变的持续进展。3.细胞因子:RA患者关节液和滑膜组织中存在多种细胞因子,包括T细胞产生IL-2、IL-4、IFN、LT等和单核/巨噬细胞产生的IL-1、IL-6、IL-8、TNF、GM-

37、CSF、TGF-、LIF、血管生成因子等。目前认为,IL-1和TNF-在导致RA滑膜炎症中起重要作用。4.凋亡异常: RA的特点是关节软骨破坏,重塑,增生和慢性滑膜炎30-31。独有的成纤维细胞应答TNF后产生基质溶解素和明胶酶,滑膜炎与这种独有的成纤维细胞增生有关32,人们认为这些成纤维细胞对关节软骨起直接作用,是导致软骨和骨破坏的重要细胞。目前认为侵蚀性成纤维细胞无法控制地增生机制生长与凋亡之间失去了平衡。2.RA中NF-B处于激活状态在人类RA早期、晚期炎症关节的滑膜组织中均可以检测到NF-B的活化33,滑膜植块的核提取物分析表明RA病人存在NF-B DNA结合活性升高,而骨关节炎病人则

38、没有34。免疫组化研究显示RelA(p65和NF-B1(p50大部份位于RA 内皮细胞和滑膜层,尤其是CD14阳性细胞,而正常滑膜则未染色35。用抗活性NF-B抗体(与IB分离进行免疫染色也得到类似的结果,活性NF-B存在于滑膜层的巨噬细胞样滑膜细胞核内以及血管内皮细胞中。Miyazawa 等人利用NF-B报导基因体外分析RA原代成纤维样滑膜细胞的单克隆的NF-B依赖的转录,在一些克隆中检测到NF-B的活性成分,值得注意的是,这些克隆自发产生大量的IL-636。这些证据表明NF-kB活化是人类RA滑膜的共同特点。在多种RA的动物模型中也检测到NF-B活化,如大鼠佐剂性关节炎37,异十八烷和链球

39、菌细胞壁诱导的大鼠关节炎38-39,胶原诱导的小鼠关节炎40。3. NF-kB与滑膜炎症自身免疫应答形成持续的、自我永存的炎症反应,RA慢性炎症开始与自身免疫应答的形成有关。实验证据表明NF-kB的活化在RA的发病初始及慢性炎症的持续期起重要的作用。4. NF-B在慢性炎症的初始抗原递呈细胞(APC与T细胞相互作用导致二者NF-B激活,T细胞受体和CD28与APC递呈的配体,MHC,共刺激分子CD80和CD86结合触发NF-kB活化。T细胞受体和CD28协同诱导T细胞激活和增殖所需的NF-B依赖性基因,如IL-2, IL-2R,IFN 41-42。随后活化的T细胞引发APC的激活。活化的T细胞

40、表达TNF超家族,CD40L,TRANCE或ODF(造骨细胞分化因子,它们与APC受体CD40和RANK诱导NF-B活化,提高APC存活和增殖能力,通过上调N F-B依赖性分子MHC ,共刺激分子CD80和CD86,刺激T细胞增殖与活化43-46。通过小鼠的观测到了NF-kB在免疫应答中的重要作用,RelB 和NF-kB2 在relb /和nfkb2 /小鼠中失活导致APC功能受损,NF-kB1 和c-Rel在nfkb1 /和rel /小鼠中缺失导致T、B细胞活化的多种缺陷,以及对致病原应答减弱47。5.NF-kB 促进Th1形成T细胞活化后CD4+Th细胞能够分化成Th1或Th2亚型。它们分

41、别产生不同的细胞因子,调节不同的免疫应答: Th1(IFN和IL-12优势细胞介导细胞免疫,激活巨噬细胞,通常认为具有促炎性作用:Th2 (IL-4 和IL-5 优势 细胞具有抗寄生虫和体液免疫,抑制巨噬细胞活化作用。通常认为具有抗炎作用。由于.NF-kB控制T h1型细胞因子IL-2,IFN,IL-12的表达,因此NF-kB激活促进T h1型细胞形成。实际上,在表达NF-kB抑制剂(I-kB不降解突变体,也称为超阻遏物I-kB转基因鼠观察到T h1应答降低,而T h2升高48-49。T细胞表达R ac2(NF-kB上游激活剂的转基因鼠相应的形成T h1型应答50。6.NF-kB与慢性炎症的持

42、续活化的T细胞分泌产物通过细胞与细胞间的作用诱导激活巨噬细胞,巨噬细胞是RA滑膜炎型细胞因子的主要生产者。IL-1、TNF是RA炎症的重要介质,NF-kB控制它们的表达。IL-1、TNF是有效地诱导激活剂,这说明NF-kB持续活化与NF-kB与一定水平的IL-1、TNF相互依赖,实际上sr I-kB 不能诱导人巨噬细胞和原代FLS产生IL-1、TNF50-52。Aupperle等人近来研究发现IKK/IKK2是NF-kB应答IL-1、TNF的而活化的主要激酶,IKK-2的DN突变体抑制细胞因子诱导的NF-kB 激活,使IL-6、IL-8、ICAM-1和胶原酶-1无法合成。相反DN IKK/IK

43、K1则没有此作用53。IKK基因敲除鼠表明IKK/IKK2是细胞因子诱导的NF-kB激活的主要途径54。通过抑制NF-kB可以抑制多种前炎性细胞因子的表达,IL-1、TNF、L-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1,但对抗炎性细胞因子IL-10、IL-2受体拮抗剂几乎没有作用55-57。说明NF-kB 活化可促进炎症关节内的促炎性因子与抗炎性因子失衡。7.NF-kB与增生正常滑膜仅有1-2层滑膜细胞,而RA滑膜则可增厚达3-7层,形成侵蚀性,肿瘤样的血管翳,它侵袭、破坏关节实验证据表明NF-kB 活化可以通过促进RA FLS增生,抑制FLS凋亡,从而出现滑膜增生。6.1 增生NF-kB 诱

44、导 c-Myc 和 cyclin D1, 细胞周期循环所需蛋白的表达，在破肌细胞和纤维细胞的生长中起阳性调节作用58-60。 Makarov 等人研究大鼠原代 FLS 发现用血小板源的生长因子（PDGF）和碱性成纤维细胞生长因子刺激后可诱导 NF-kB 活化, NF-kB 活化是 c-Myc 和 DNA 合成所必需的58。相反具有丝裂原活性的胰岛样生长因子-1 不能激活 NF-kB，也不为 NF-kB 抑 制剂所影响（未发表） 。NF-kB 在 FLS 丝裂原保护细胞免受 c-Myc 的细胞毒性。尽管增殖需要 c-Myc，但是除非存在一定的存活 因子，否则 c-Myc 会导致细胞死亡。PDGF

45、 就是这样的因子，它能够对抗 c-Myc 的促凋亡倾向。Makarov 发现阻断 NF-kB 会导 致 PDGF 的保护作用丧失，这说明在 PDGF 途径，NF-kB 传递两种信号，一是诱导 c-Myc 所需的，另一个是抗凋亡信号，中和 c-Myc 的细胞毒性， 可以认为是诱导产生了一个或多个保护性基因58。 c-Myc 在 RA 滑膜中过度表达， NF-kB 活化后抑制 c-Myc 诱导的凋亡，促进滑膜增生增殖。有重要意义的是 PDGE 诱导的 NF-kB 活化涉及到磷脂酰肌醇-3 激酶PI(3K/Akt，和蛋白 激酶 B/Akt， 目前已经清楚 PI(3K/Akt 途径涉及多种人类恶性疾病

46、的发病过程,这说明 RA 和肿瘤在增生形成方面有相似的机制。 62 凋亡 很多促凋亡刺激物，如 TNF，射线、化疗能够激活 NF-kB，在大多数细胞中 NF-kB 传递抗凋亡信号。NF-kB 抑制凋亡表明它 激活了抗凋亡基因，包括 TRAF1 、 TRAF2、c-IAP1 、c-IAP2、 Bcl-2 同源 A1/Bfl-1 和 Bcl-xL、IEX-1、 XIAP 61。阻断大 鼠原代 SCW FLS NF-kB 活化能够大大地增强 TNF 和 FasL 的细胞毒性，与此一致，体内使用不同的 NF-kB 抑制剂，如蛋白酶 体 抑制剂、sr-kB 的腺病毒转基因结构，能够加速异十八烷及 SCW

47、 诱导的大鼠关节炎关节内的凋亡50。zhang 等人与此 观点一致，他们在人 RA/SCID 鼠模型中观察到 NF-kB 活化能够对抗 TNF 对 RA FLS 的细胞毒性,大概是通过诱导抗凋亡蛋白 XIAP 来实现的60。这些结果表明 NF-kB 可能是通过抑制 TNF 和 FasL 的细胞毒性在防止 RA FLS 发生凋亡中起了重要作用。 因为在 RA FLS 中 TNF 是一种有力的丝裂原，所以 NF-kB 是以一种重要开关的形式决定 TNF 是执行丝裂原还是促凋亡的作 用。前面提到 PI(3K/Akt 途径在肿瘤细胞的存活和增殖方面具有显著作用，NF-kB 是其中重要的环节。实验表明

48、PI(3K/Akt 途径可以对多种刺激物产生应答，如 PDGF 58、TNF63、IL-1 64、 bradykinin 65、 致癌性 H-Ras 66 、Her-2/neu 67。调节 NF-kB 活化。Akt 依赖性 NF-kB 活化能够调节 PDGF58和 Her-2/neu 67的抗凋亡功能，通过下调 c-Myc 58、 H-Ras 66、NF67。制细胞死亡。Akt 如何精确激活 NF-kB 依赖性转录依然有不少争论。一些小组认为与 IKK 有关，因此涉 及到 NF-kB 依赖性机制 63,65,67,68,69，另有些学者认为是 NF-kB 非依赖性机制，是 Akt 使 NF-k

49、B 具有了转录功能64,66。 Akt 与 NF-kB 的连接机制及 NF-kB 途径在 Akt 抗凋亡功能中的作用很有可能与细胞和刺激物类型有关。 在 RA 发病机制及在 Akt RA 滑膜中对 NF-kB 活化的作用尚不清楚，但照理看二者之间肯定按存在联系，值得进一步探讨。 NF-kB 与组织改型 目前认为 RA 关节破坏主要是 FLS 的作用，RA 关节炎性环境造成了 FLS 的侵蚀性表型，有证据说明 NF-kB 活化为 FLS 提供了 破坏能力。首先，NF-kB 调节一些基质金属蛋白酶（MMP）的活化，MMP-1 的启动子具有 NF-kB 结合位点，它是通过 IL-1 刺激 MMP-1 产生所必需的70。而且 NF-Kb 活化是引发 MMP-3、 MMP-9、MMP-13 表达所必需的 71-73。第二，COX-2 和 诱导型 NOS 催化前炎性因子前列腺素和 NO 代谢物的合成，NF-Kb 活化对引发