氘代同位素内标气相色谱_质谱法测定鱼贝类肌肉中_雌二醇残留

1、氘代同位素内标气相色谱2质谱法测定鱼贝类肌肉中2雌二醇残留邹龙林洪3江洁(中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛266003摘要建立了不同鱼贝类肌肉组织中以氘代同位素为内标测定2雌二醇残留量的气相色谱/质谱(GC /M S 方法。样品中加入内标2雌二醇2D 2和乙酸钠缓冲溶液匀质后,用乙腈超声提取,经过正己烷脱脂,C 18固相萃取柱净化和柱前三甲基硅烷化后,进行GC /M S 分析。根据2雌二醇和内标衍生物保留时间、主要特征离子及其相对丰度和平均质谱图定性;选择离子监测(SI M 模式下,根据2雌二醇和内标衍生物定量离子质量色谱图的峰面积比值,内标标准曲线法定量。实验结果表明,在0.0050.2

2、5mg/L 范围内,衍生物定量离子峰面积比值与2雌二醇浓度呈现良好线性关系,相关系数为0.9995;方法定量检出限为0.2g/kg 。当添加水平为0.25.0g/kg 时,回收率为68.5%100.1%,相对标准偏差为4.8%10.1%。通过对市场上7种鱼贝类的检测,进一步证明该法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析。关键词雌二醇,水产品,氘代内标,衍生化,固相萃取,气相色谱2质谱2006210219收稿;2007203207接受本文系本文系农业部行业标准“水产品中雌二醇残留量的测定2气相色谱2质谱法”基金资助项目(No .473E 2mail:linhongouc .edu .cn1引言

3、雌二醇(ES 是一种天然雌激素,属于甾类同化激素,有和两种构型。由于2雌二醇为生物学效应最强的内源性雌激素而被广泛应用于临床1;ES 具有较强的蛋白质同化作用,能促进动物生长,并可使动物单性化,减少过度繁殖,提高产量,而被用于水产养殖业2。但2雌二醇可在动物组织内形成残留,通过食物链进入人体,易导致儿童性早熟、男孩女性化,致畸致癌1等,严重威胁人类的健康。国外有关尿3、血4、畜禽组织58中2雌二醇残留检测的文献报道较多,但未见对水产品,尤其是鱼贝类肌肉组织的专门报道。国内关于动物源性食品中该物质的残留量检测有少量报道9,10,且研究对象只限于一种鱼贝类,有其局限性。目前所用的分析方法有放射免疫

4、测定法(R I A 11、高效液相色谱法(HP LC 10、气相色谱2质谱法(GC /MS 39,12和液相色谱2质谱法(LC /MS 13等。相比较而言,GC /MS 法比较适合低浓度水平(g/kg 雌二醇的分析。采用适当的衍生化技术和选择离子监测(SI M 模式,即使在鱼贝类肌肉组织低目标物浓度、高基质背景的情况下,也能消除背景干扰,改善灵敏度,提高检出限。但目前国内尚没有成熟的针对鱼贝类肌肉组织中2雌二醇残留检测的GC /MS 确证方法。本研究建立了不同鱼贝类肌肉组织中2雌二醇残留量的GC /MS 测定方法。2实验部分2.1仪器与试剂6890N /5973I 气相色谱/质谱联用仪(美国A

5、gilent 公司,配分流/不分流毛细管柱进样器和GC 2MS 化学工作站;Labor ota 40012efficient 旋转蒸发仪(德国Heidol ph 公司;BR4i 高速冷冻离心机(法国Jouan 公司;12通道半自动固相萃取装置(美国Supelco 公司;氮气浓缩仪(北京康林科技有限责任公司。2雌二醇(2Estradi ol,W ako 公司,纯度97%;2雌二醇2D 2(2Estradi ol 2D 2,Sig ma 公司,纯度98%;N 2甲基2N 2三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTF A ,Sig ma 2A ldrich 公司,纯度为99%;二硫赤藓糖醇(DTE,A lfa

6、Aesar 公司,纯度为99%;三甲基碘硅烷(T M I S,Fluka 公司,纯度98%;乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯(Fisher 公司,其余试剂为分析纯;Cleanert ODS C 18固相萃取柱(Agela 公司,500g/3L,封端。第35卷2007年7月分析化学(FE NX I HUAXUE 研究报告Chinese Journal of Analytical Che m istry 第7期9839872.2标准溶液配制用甲醇分别配制2雌二醇和2雌二醇2D2标准贮备溶液为100mg/L和200mg/L,-18冰箱避光存放。临用前,分别用甲醇稀释成一系列浓度梯度的2雌二醇标准工作溶液

7、和0.05mg/L的内标标准工作溶液。取0.2mol/L乙酸钠溶液237mL和0.2mol/L乙酸溶液63mL,混匀,用冰乙酸调pH,得到0.2mol/L pH5.2的乙酸钠缓冲溶液。在无水条件下配制衍生化溶液:0.0020g DTE溶解于1mL MST2F A,然后在液面下加入2L T M I S,混匀,放置过夜后使用,低温避光防潮密封保存。2.3样品处理2.3.1匀质和提取取鱼贝类肌肉组织,用家庭用搅拌器制样后于-18冷冻保存备用。准确称取5.00g试样于50mL离心管中,加入100L内标标准工作溶液及5mL乙酸钠缓冲溶液,用匀质器以18000r/m in匀质2次,每次30s后,加入10m

8、L乙腈,充分旋涡混合1m in,室温下超声提取15m in。取出离心管,以10000r/m in于4离心10m in,上清液倒入另一离心管中。残渣中加入10mL乙腈,按上述方法再提取一次,合并上清液。2.3.2净化加入10mL正己烷,加塞剧烈振荡12m in,以10000r/m in于4离心5m in,吸弃正己烷层,下层溶液用正己烷重复洗涤一次,合并离心后的溶液于鸡心瓶。加入0.5mL正丙醇,于45水浴条件下旋转蒸发至干。残渣中加入1mL乙腈,超声波清洗瓶壁1m in后,吸至5mL注射器中。再用1mL乙腈提取一次,合并溶液并经有机系针头过滤器过滤,再用水稀释至10mL。样液过C18SPE小柱(

9、过柱前,依次用6mL甲醇、3mL0.1%乙酸溶液和3mL水活化,流速控制在12mL/m in。用3mL水洗涤C18柱,弃掉流出液。然后用9mL乙腈洗脱,收集洗脱液,氮气吹干。2.3.3衍生化在残渣中准确加入100L MSTF A2DTE2T M I S衍生化试剂,盖紧塞子并旋涡混合1m in,在60烘箱中反应30m in,冷却至室温,于48h内进行气相色谱2质谱分析。进行标准溶液的衍生化时,先吸取雌二醇和内标标准工作溶液于去活样品反应瓶(美国Agilent公司中,旋涡混合并氮气吹干,然后同上进行衍生化反应。2.4色谱和质谱条件HP25MS毛细管柱(25m0.32mm0.52m;柱初始温度120

10、(2m in15/m in2505/m in300(5m in;载气He(99.999%,流速1.0mL/m in;进样口温度250;不分流进样1L。E I离子源和四极杆温度分别为230和150;接口温度280;电离电压70e V;溶剂延迟3m in;电子倍增器电压为1106V;扫描质量范围为40500a mu。3结果与讨论3.1样品处理条件的选择及优化3.1.1提取溶剂的选择雌二醇难溶于水,在弱极性或中等极性的有机溶剂中有较好的溶解度。尝试用甲醇2缓冲盐溶液、乙腈2缓冲盐溶液、乙腈、氯仿、二氯甲烷、丙酮及乙醚作为提取溶剂。从提取效率来看,除了氯仿和乙醚在80%以下,其余提取溶剂都相差不大,可

11、达95%以上。但考虑到鱼贝类肌肉组织中各种内源性杂质多,蛋白质和油脂含量较高的特点,而乙腈对动物蛋白具有良好的沉淀作用,与其它溶剂相比,对脂类化合物的溶解度较小;实验中发现,在对雌二醇低浓度尤其是接近检出限的样品进行定量时,基质中有与雌二醇基峰离子(m/z416相同的碎片离子,严重干扰雌二醇的定量。所以,先加入缓冲液不仅可以调节溶液pH为酸性,使雌二醇保持分子状态,而且把产生干扰碎片离子的碱性物质去除了,便于定量离子的选择。故本方法选用乙腈2乙酸钠缓冲溶液(pH5.2作为雌二醇的提取溶剂。3.1.2C18柱净化在文献6,7中,大多根据杂质的性质采用23种不同填料的SPE小柱进行净化。本实验通过

12、优化条件,选用一种填料的SPE小柱,既减少成本,又能达到较好的净化效果。上样前用水进行适当的稀释以降低乙腈的强度,使雌二醇能够保留在SPE小柱上。在其它条件相同的情况下,比较了不同类型、不同种类填料和不同填料量C18固相萃取柱对2雌二醇回收率的影响,结果见489分析化学第35卷表1。通过比较,最终选择了回收率最高的Cleanert ODS C 18固相萃取柱(500g/3L,封端。表1固相萃取柱提取效率的比较Table 1Comparis on of the extracti on efficiency of different SPE cartridges种类Kind 安捷伦Accubond

13、 (Agilent Accubond 500mg200mg 艾杰尔Cleanert (Agela Cleanert 封端200mg Capped 200mg 未封端500mg not 2capped 500mg 封端500mg Capped 500mg 回收率Recovery (%86.194.996.799.399.8注(notes :未封端(not 2capped ,填料表面存在较多的硅醇官能团,能提供额外的极性相互作用(existence of many silanol functi onal gr oup s with extra polar interacti on on the s

14、urface of filler ;封端(capped ,则反之(absence of silanol functi onal gr oup s with extra polar interac 2ti on on the surface of filler 。3.1.3衍生化条件的选择雌二醇及氘代物结构中含有芳环,侧链C 3、C 17为极性基团,低挥发性,因此不适合直接进行GC /MS 分析。常用的解决办法就是将其C 3、C 17羟基衍生化(硅烷化、酰化和烷基化为醚类(bis 2O 2T MS 。实验中选用了七氟丁酸酐(HF BA 、N 2甲基2N 2三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTF A 和M

15、STF A 2T M I S 2DTE 3种衍生化试剂进行比较。结果表明,MSTF A 2T M I S 2DTE 能把雌二醇及氘代物的两个羟基定量硅烷化,且衍生化条件温和、速度快、效率高,能得到较强的分子离子峰(见图1。T M I S作为催化剂,加速衍生化反应;DTE 是抗氧化剂,能使衍生化溶液稳定14。由于衍生化试剂遇水立即分解,因此在操作中应特别注意防潮。衍生化反应在室温下也能进行,但重复性差6,参照文献14以及实验证明,选择衍生化温度为60。在其它条件相同的情况下,将2雌二醇标准衍生反应不同时间。结果表明,反应时间在2045m in 时 ,衍生反应比较完全,时间过长,反应副产物增加,比

16、值降低。因此,采用30m in 为反应时间。图12雌二醇(a 和2雌二醇2D 2(b 三甲基硅烷化衍生物的结构和E I 全扫描质谱图Fig .1Structure and E I full scan mass s pectra of tri m ethylsilylated 2estradi ol (a and 2estradi ol 2D 2(b 将衍生后的2雌二醇标准和样品溶液放置不同时间后测定。结果表明,由于基质作用的存在,样品溶液衍生产物稳定性比标准溶液差。标准溶液衍生产物,在96h 内峰面积不显著变化;而样品溶液衍生产物,尽管不同浓度之间峰面积变化没有明显差异,但都在48h 后,有或

17、多或少的降低。因此,衍生反应后,尽量在48h 内进行气相色谱2质谱分析。3.2GC 2M S 分析结果为了使目标峰与试剂及其它干扰因素峰分开,采用程序升温进行GC 色谱分离(见图221,MS 提高检测的选择性和灵敏度。尽管如此,在全扫描模式总离子流色谱图(TI C 上,由于鱼贝类肌肉组织本底基质复杂,加上目标化合物浓度很低,峰形不好,甚至被本底掩盖。为此,实验在SI M 模式下通过提取离子流色谱图(extracted i on chr omat ography 对目标化合物进行追踪,消除很大一部分的背景干扰,利用保留时间和衍生物主要特征离子及其相对丰度进行定性分析(见表2。虽然2雌二醇/2雌二

18、醇2D 2衍生物在全扫描TI C 上不能基线分离,但可以通过两者的特征碎片离子,在SI M 模式下利用质量色谱图对它们进行“分离”和准确定量。如图222和图223所示,2雌二醇/2雌二醇2D 2衍生物定量离子没有受到样品基质碎片离子的干扰,峰形良好,显著提高了信噪比。589第7期邹龙等:氘代同位素内标气相色谱2质谱法测定鱼贝类肌肉中2雌二醇残留表2SI M 模式下2雌二醇和2雌二醇2D 2衍生物及其特征诊断离子Table 2Derivatives of 2estradi ol and 2estradi ol 2D 2and their diagnostic i ons acquired in

19、selected i on monit oring (SI M mode组分Analyte 分子量Molecular weight 保留时间Retenti on ti m e (m in 衍生物DerivativeT MS 衍生物特征诊断离子D iagnostic i ons of T MS 2derivative f or 定量离子Screeningm /z 确证离子Confir mati on m /z m /z 衍生物碎片离子Derivative frag menti on2ES 27215.410.10bis 2O 2T MS 416416(100,285(74,326(16,232(

20、14M +2ES 2D 227415.400.10bis 2O 2T MS 418-M +3:括号内为相对强度(the number in parentheses is relative intensity 。T MS:tri m ethylsilyl .图2标准及样品色谱图Fig .2Chr omat ogra m s of standards and sa mp les1.全扫描模式下2雌二醇和2雌二醇2D 2标准溶液的总离子流色谱图(t otal i on chr omat ogra m of standard 2estradi ol and2estardi ol 2D 2in full

21、 scan mode ; 2.选择离子模式下添加于鲫鱼肉中2雌二醇(5g/kg 衍生物定量离子的质量色谱图(extracted i on chr omat ogra m of a crucian meat sa mp le s p iked with 5g/kg 2estradi ol in SI M mode ; 3.选择离子模式下添加于鲫鱼肉中2雌二醇2D 2(1g/kg 衍生物定量离子的质量色谱图(extracted i on chr omat ogra m of a crucian meatsa mp le s p iked with 1g/kg 2estardi ol 2D 2in

22、SI M mode 。3.3方法评价实验采用内标标准曲线法定量。配制浓度为0.005、0.01、0.03、0.05、0.1和0.25mg/L 2雌二醇标准溶液,取100L 不同浓度的该标准溶液,分别加入100L 内标标准工作溶液,衍生化,GC /MS 测定后,以雌二醇与内标衍生物的定量离子峰面积比值为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标作图,得到内标标准工作曲线。结果表明,2雌二醇在浓度为5250g/L 的范围内呈良好的线性关系,线性方程为y =12.623x +0.1741,相关系数为0.9995。以空白样品加标,S /N =10所对应的2雌二醇的浓度求得方法定量检出限为0.2g/kg 。在空白鱼贝

23、类肌肉组织基质(鲅鱼、鲫鱼、刀额新对虾中进行3个浓度水平的添加回收实验,结果见表3。表32雌二醇在不同鱼贝类肌肉组织基质中的回收率(n =5Table 3Recoveries of 2estradi ol in muscle tissue matrices of different fishes/shellfishes (n =5样品Sa mp le 添加水平Sp iked level (g/kg 检出量Found (g/kg 平均回收率Recovery mean (%,n =5相对标准偏差RS D (%,n =5鲅鱼Japanese s panish mackerel 5.04.2985.8

24、 5.01.00.7777.3 574.88.0鲫鱼Crucian 5.04.6392.6 4.81.00.830.1576.8 6.6刀额新对虾Greasy 2back shri m p5.04.7494.9 6.91.00.6783.87.00.20.1577.710.13.4样品分析为考察本方法的适用性,按上述实验方法对市售的鲜活鱼贝类进行了抽检,样品包括鲫鱼、鳗鱼、草689分析化学第35卷鱼、鲤鱼、鳕鱼、鲅鱼和刀额新对虾。结果显示,除雌性刀额新对虾外,其它6种鱼贝类肌肉组织中均未检测出2雌二醇。References1Hu W ei (胡伟,Huan

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