调肝方药对束缚应激大鼠神经内分泌免疫功能的调节作用

1、    调肝方药对束缚应激大鼠神经内分泌免疫功能的调节作用        摘要目的：探讨调肝方药对束缚应激大鼠神经内分泌免疫功能的调查作用。方法：以束缚制动作为应激原复制应激反应大鼠模型，采用放射免疫法检测模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，同时检测模型大鼠有关免疫功能的变化，并观察调肝方药的调节作用。结果：束缚应激大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)兴奋亢进(P0.01或P0.05)；脾淋巴细胞增殖反应降低(P0.01)，腹腔巨噬细胞(M)释放HO功能下降(P0.01)。

2、而调肝方药能抑制HPAA的兴奋性，提高大鼠的免疫机能。结论：调肝方药对束缚应激所引起的神经内分泌免疫功能的紊乱具有一定的调节作用。主题词应激；下丘脑-垂体系统；免疫，细胞；巨噬细胞中分类号R392.6文献标识码A文章编号1000-4718(2000)06-0560-03 Regulation of Tiao Gan Fang Yao on neuroendocrine-immuno-function of bandage-stressed ratsYAN Can, DENG Zhong-yan, WANG Jian(Department of Basic Sciences, Basic Med

3、icine College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Drugs, Guangzhou 510405, China)CHEN Xiao-yin(Department of Traditional Chinese Medical, Jinan University, Guangzhou 510632)Abstract AIM: To investigate the regulation of Tiao Gan Fang Yao(TGFY) on neuroendocrine-immuno-functio

4、n of bandage-stressed rat . METHODS:The stressed rat model was made by bandage. RIA was adopted to measure the function of hypothalamus-pitutary-adrenal gland axis (HPAA) of stressed rat. Meanwhile, the immunity of stressed rat and the regulation of TGFY were observed.RESULTS:Bandage stress increase

5、d the contents of serum corticosterone(CORT), and ACTH, and hypothalamus corticotropin releasing hormone (P0.01 or 0.05), which suggested that the excitability of HPAA was enhanced. In addition, bandage stress reduced spleen lymphocyte proliferation (P0.01) and decreased HO releasing from the macrop

6、hages significantly (P0.01). While TGFY could decrease HPAA excitability of bandage-stressed rat and strengthen its immunity.CONCLUSION:TGFY could regulate disorder of neuroendocrine-immuno-function of bandage-stressed rat.MeSHStress; Hypothalamo-hypophyseal system; Immunity, cellular; Macrophages七情

7、致病理论是中医病因病机学中的一个重要内容，但有关中医七情致病机制的研究开展的较少，这可能与很难复制出符合中医七情致病特点的动物模型有关。现代医学中的应激学说与中医七情理论在认识上存在着许多共同点，我们从应激角度出发，结合中医“怒伤肝”的理论，以束缚制动作为应激原，复制激怒应激反应大鼠模型，并探讨调肝方药(Tiao Gan Fang Yao, TGFY)对应激大鼠神经内分泌免疫功能的影响。材料和方法一、主要试剂细胞培养液RPMI-1640(Gibco产品)，刀豆素A(ConA, Sigma产品)，3H-TdR(中国科学院原子能研究所产品)。莨菪葶(scopletin, 9.61 g, Sigma

8、产品)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP, 10 g, Sigma产品)，十四酰佛波乙酸酯(phorbol myristate acetate, PMA, 100 ng, Sigma产品)。125I-CRH、125I-ACTH、125I-CORT放免检测药盒(美国DPC产品)。二、动物模型复制及分组处理实验动物选择雄性Wistar远交系大鼠，体重250300 g，分为3组：正常对照组10只(大鼠正常饮食，不给任何刺激)；束缚应激组10只(给予束缚刺激，正常饮食，不给中药治疗)；束缚应激+调肝方药组10只(给予束缚刺激的同时灌胃调肝方药治疗)。束缚应激反应大

9、鼠模型的复制：取雄性Wistar远交系大鼠20只，体重250300 g，每2只1笼，每日给予黑暗和光照各12 h,2022，同时给予每日1次成对双后肢的立式束缚，以引起明显的激怒应激反应(粗叫、站立对峙、扭打嘶咬)，首次30 min，以后隔日增加10 min，共2周。普通饲料，自由饮水。于实验第13 d和第14 d在动物清醒、安静状态下断头处死取材。三、药物组成剂量及给药方法所用中药均由本校第一附属医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材。调肝方药组成及剂量：柴胡15 g，白芍15 g,香附10 g，山萸肉15 g，郁金10 g，枳壳10 g。将上述药物制成100%水煎剂，每毫升含生药1 g，给

10、予大鼠1 mL/100 g体重灌胃，每日2次，共2周。对照组及各应激组灌服等量生理盐水。四、下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamus-pitutary-adrenal gland axis, HPAA)功能测定采大鼠血清测皮质酮(corticosterone, CORT),以EDTA抗凝血测促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)，具体方法按试剂盒说明书要求进行。大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)放免检测：按文献1、2取大鼠下丘脑，并移至备有0.1 mol/L盐酸

11、2 mol/L醋酸=11的1 mL溶液的试管中。采用组织匀浆器4000 G匀浆20 s，煮沸加热3 min,2 000×g离心20 min，取上清液保存于-20待测3，具体检测方法按试剂盒说明书要求进行。五、脾淋巴细胞增殖反应试验无菌取脾，Ficoll分离脾细胞，调整细胞浓度至1×107mL，每孔0.1 mL,每鼠3个复孔。每实验孔加ConA 5g，对照孔加等体积完全培养液(RPMI-1640)。每孔总反应容积为0.2 mL。饱和湿度，5%CO，37培养40 h，于终止培养前16 h每孔加3.7×104 BqH-TdR。多头细胞收集仪收集细胞，测每分钟计数值(co

12、unts.min-1)2。刺激指数(stimulating index, SI)=实验孔counts.min-1/对照孔counts.min-1。六、腹腔巨噬细胞(macrophage, M)释放HO功能测定按Nathan方法4：将贴壁M以RPMI-1640培养液制成2×10cells/mL的悬液，注入24孔细胞培养板内(1 mL/孔)，在CO孵育箱内37孵育20 h，取出后弃去上清液，以葡萄糖磷酸缓冲液(Krebs-ringer phosphate glucose, KRPG)冲洗细胞2次，然后每孔加入1.5 mL KRPG液，内含莨菪葶、辣根过氧化物酶和十四酰佛波乙酸酯。孵育1

13、h，使用荧光分光光度计(MPE-4，Hitachi)测定荧光强度。激发波长370 nm,发射波长462 nm。另取6支试管分别加入分析纯HO，使终浓度为1.25，2.5，5， 10，20和40mol/L，并测定荧光强度作为标准曲线。七、统计处理数据以<"01.jpg (732 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s表示，均数间比较采用t检验。结果一、调肝方药对应激大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的影响应激组大鼠血浆CORT、ACTH以及下丘脑CRH含量明显高

14、于对照组(P0.05)，提示应激可使大鼠HPAA兴奋；而调肝方药对HPAA的亢进状态有一定的抑制作用(P0.05)。结果见表1。表1调肝方药对应激大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的影响Tab 1The effect of TGFY on HPAA of stressed rat (<"01.jpg (732 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10)GroupCORT(ng/mL)ACTH(pg/mL)CRH(ng/hypothalamus)Cont

15、rol9.36±1.7249.3±10.22.34±0.81Stressed13.67±2.29?*92.2±18.9?*4.58±1.42?*Stressed+TGFY10.11±1.5651.4±9.72.47±0.45     ?*P0.01， vs control group; P0.05，vs stressed group 二、对应激大鼠淋巴细胞增殖反应的影响应激组大鼠脾淋巴细胞增殖反应明显低于对照组(P0.01)；调肝方药能提高应激大鼠的淋巴细胞增殖反应

16、，但未达到正常水平(P0.01)。结果见表2。表2调肝方药对应激大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响Tab 2 The effect of TGFY on spleen lymphocytes proliferative response of stressed rat （<"01.jpg (732 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10)GroupSpleen lymphocytes proliferativeresponse 3H-TdR (coun

17、ts*min-1)SIControl31 032±3 27610.8±4.3Stressed13 861±1 359?*4.6±1.6?*Stressed+TGFY27 221±2 1428.6±2.5     ?*P0.01，vs control gorup； P0.01，vs stressed group 三、调肝方药对应激大鼠腹腔M释放HO功能的影响如1所示，应激组大鼠M释放HO量明显低于对照组(P0.01)； 调肝方药能明显提高M释放HO的功能(P0.01)。见1。  

18、;   Fig 1The effect of TGFY on the release of HOfrom M (<"01.jpg (732 字节)" src="/med/cano/201003/20100309191726553.jpg" 15 17>±s,n=10) ? P0.01, vs control group; P0.01, vs stressed group1调肝方药对应激大鼠腹腔M释放HO功能的影响讨论应激是机体处于不利的内外环境条件下所作的一系列反应。国外已有研究证实情绪性应激可以明显影响机体的免

19、疫功能。应激或心理防御机制的破坏与多种疾病的发生发展有着密切的关系。中医学强调“正气存内，邪不可干”，其中正气应当包括机体正常的神经精神活动，若情志活动异常，则会影响到脏腑及气血的功能而产生病变，即中医所谓的“七情内伤”。目前对应激的研究多是从神经、内分泌及免疫系统的相互关系来加以探讨。1977年Besedovsky首先提出“神经内分泌免疫调节(neuroendocrine-immuuno-modulation, NIM)网络学说”，阐述了神经内分泌与免疫的关系。在NIM网络研究中，HPAA备受关注。糖皮质激素、ACTH、CRH等是HPA轴的主要调节物质，其中糖皮质激素是HPA轴的终末产物。现

20、已证实，糖皮质激素(在大鼠主要为皮质酮)对免疫功能的多个环节起抑制作用。本实验采用束缚制动作为应激原，复制应激大鼠模型。当大鼠受到束缚后，由于激怒，使得交感神经兴奋，神经内分泌可分泌CRH，促使ACTH的产生，此激素作用于肾上腺皮质，使之分泌大量的糖皮质激素，从而适应应激的需要。本实验观察到应激大鼠血浆CORT、ACTH以及下丘脑CRH含量升高，说明HPAA兴奋性升高，同时大鼠脾淋巴细胞增殖反应降低，提示束缚激怒应激可导致细胞免疫功能低下，血浆CORT的升高可能是抑制细胞免疫功能的主要原因。M是免疫系统中一类重要的防御和调节细胞，其合成并释放的活性氧物质对微生物及肿瘤具有杀伤作用。本实验观察到应激大鼠腹腔M释放HO功能明显下降，说明应激对M释放HO具有抑制作用。结合应激大鼠血浆CORT的升高，我们认为这种抑制作用与下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统的调节作用有关，这也可能是糖皮质激抑制机体免疫反应的机制之一。中医认为“怒伤肝”，而对情志活动的异常则往往采用疏肝养肝之法。我们采用调肝方药应激大鼠进行治疗。本实验结果表明，大鼠HPAA兴奋状态可以被中药复方所调整，大鼠细胞免疫功能的下降及腹腔巨噬细胞释放HO功能的降低可被中药复方所拮抗，说明调肝方药有效地参与了HPAA的调节，在总体上具有抑制HPAA的兴奋性，促进免疫机能的效应，其机理可能与其激