金雀根对类风湿性关节炎动物模型抗炎作用的研究

1、2009年10月第31卷 第10期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineOctober2009Vo.l31 No.10在氧自由基损伤反应,而自由基损伤又可能通过多种途径参与高血压及靶器官损害的演变进程。本实验结果表明白子菜水提物能明显降低SHR的血压,其降压作用可能与升高血清中NO水平,降低血清ET水平,调整体内NO与ET平衡状态有关,并具有良好的提高SOD活性而发挥抗自由基损伤,达到保护内皮细胞和心、脑、肾等靶器官损害的作用。白子菜是否还能通过其它途径达到降压功效尚需作进一步的研究探讨。参考文献:1 王吉耀.内利学M.北京:人民卫生出版社,2001:229.2

2、 汪泓江,梁呈元,卓敏,等.Gynura属3个野生蔬菜营养成分的比较及评价J.中国野生植物资源,2004,23(5):48249.3 冼寒梅,周 蓉,韦乃球.壮药神仙草的性状及民间应用J.亚太传统医药,2007,3(9):29230.4 冯建章.当代心脏病学M.广州:广东教育出版社,2000:69270.5 刘力生.高血压M.第2版.北京:人民卫生出版社,2001:2342235.金雀根对类风湿性关节炎动物模型抗炎作用的研究乔丽君, 汪 悦, 陈华尧, 陆 黎, 周腊梅, 夏卫军, 高 曌, 马顾全, 顾向浩(1.南京市中医院,江苏南京210001;2.南京市中医药大学,江苏南京210000)

3、关键词:金雀根;类风湿性关节炎;抗炎免疫作用;实验研究摘要:目的:探讨金雀根药物在治疗类风湿关节炎中的抗炎免疫作用。方法:取健康性SD大鼠50只,用微量注射器于左后足跖皮内注射FCA出现继发性多发性关节炎,致炎前及后每隔两天计算每只大鼠左足=踝体积与右足=踝体积之差计算关节炎得分;设正常组、模型组、金雀根高、中、低剂量组、雷公藤多苷片组,灌胃给药后处死动物,取其踝关节切片染色观察关节组织病理改变轻重程度。结果:¹金雀根高、中剂量组关节炎评分明显低于模型组;º大鼠造模后6、10d,金雀根高、中剂量组关节肿胀度小于模型组;»金雀根高、中剂量组的大鼠踝关节组织病理改变明

4、显较轻,与模型组相比差异显著。结论:金雀根可降低踝关节组织病理改变,降低关节炎评分;抑制SD大鼠足爪肿胀,减少关节炎发生率。具有良好的抗炎、免疫调节作用。中图分类号:R285.6 文献标识码:A 文章编号:100121528(2009)10215082042*2222类风湿性关节炎(RA),是一种以关节和关节周围组织的非感染性炎症为主的全身性疾病,如累及其他脏器,可引起心包炎、心肌炎、胸膜炎、间质性肺炎、肾淀粉样变以及眼部疾患(如巩膜炎、虹膜炎),还可并发血管炎以及末梢神经损害等。根据类风湿性关节炎的临床表现,以肢体关节疼痛为主症,当属中医痹证范畴,历代医学家称之为历节、鹤膝风、顽痹、筋痹、骨

5、痹、肾痹等。5中医病证诊断疗效标准6则将本病已定病名为/骨痹0、/尪痹0。并通过临床和实验研究进一步发现肾虚是其发病的根本原因,治疗上要重视补益肝肾以治收稿日期:20082092181其本,同时祛风散寒,活血通络以治其标。研究建立关节炎鼠动物模型,选择雷公藤多苷片为对照,观察金雀根抗炎免疫等方面的作用,在公认的中药药理学实验基础上进行科学研究,为开发治疗类风湿关节炎确有疗效的方药打下良好的基础。1 实验材料1.1 药品与试剂金雀根浸膏,每10g浸膏相当于8g生药,由南京中医药大学第一临床医学院实验中心制备提供,批号:20070401;卡介苗(BCG),上海生物制品研究作者简介:乔丽君(1972

6、-),女,副主任医师,硕士,主要从事风湿免疫及重症监护方面的研究。Te:l(025)85104314E2mai:lqq04716291981*通讯作者:汪 悦,教授。Te:l(025)8679800515082009年10月第31卷 第10期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineOctober2009Vo.l31 No.10所,批号:20060402;液体石蜡,南京化学试剂厂,批号:20040112;甲醛,南京化学试剂厂,批号:2005045;雷公藤多苷片,三九黄石制药厂,批号:20040512。1.2 实验动物SD大鼠,由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,生

7、产许可证:SCXK(沪)200320003;南京中医药大学实验动物中心,实验动物使用许可证:SCXK(苏)200220123。1.3 实验仪器CTM22型倒置显微镜,日本Oympus;YLS27B型大鼠趾体积测量仪,山东省医学科学院设备站。2 实验方法2.1 佐剂性关节炎模型建立2.1.1 弗氏完全佐剂(FCA)制备 BCG于80e水浴灭活1h,用灭菌液体石蜡制成7.5mg/mL的乳剂,得FCA。2.1.2 佐剂性关节炎模型复制 造模及给药方法2模型构建方法参阅文献:除空白组外,取健康性SD大鼠50只,用微量注射器于左足跖处注射0.1mL完全Freud佐剂,致炎成佐剂性关节炎模型,空白组注射生

8、理盐水0.1mL。约10d左右,出现继发性多发性关节炎。2.2 佐剂性关节评价致炎当天为d0,致炎前及后每隔两天用大鼠足跖体积测量仪测量大鼠左右足跖体积,计算每只大鼠左足=踝体积与右足=踝体积之差,即为关节肿胀度。同时称量大鼠体重,并观察鼠耳红斑、尾结节出现情况。关节炎得分计算:0分为正常;1分为仅限于部分关节或脚趾的轻度发红或肿胀;2分为趾关节和足跖或踝关节出现中度肿胀;3分为踝关节严重肿胀或踝关节以下全部肿胀;4分为整个脚爪全部肿胀或关节严重变形。4个脚爪的评分之和作表1分组正常组模型组金雀根高组金雀根中组金雀根低组雷公藤片组动物数/只101010101010*为每个小鼠的关节炎评分。四肢

9、关节炎得分每只合计最高可得16分。2.3 分组及处理动物随机分为6组,每组10只,即:(1)正常组,给予等容积蒸馏水;(2)模型组,给予等容量蒸馏水;(3)金雀根高剂量组,给予金雀根2.5g生药/kg;(4)金雀根中剂量组,给予金雀根1.25g生药/kg;(5)金雀根低剂量组,给予金雀根0.625g生药/kg;(6)雷公藤多苷片组,给予雷公藤多苷片0.06g/kg。均灌胃给药,给药体积为15mL/kg,于造模当天开始给药,连续给药28d。2.4 病理组织学检查方法处死动物,取其踝关节固定于10%福尔马林内,脱钙后常规石蜡包埋,切片厚45Lm,HE染色,由病理专业人员阅片,观察关节滑膜被覆上皮有

10、无细胞变性,增生,间质有无炎细胞浸润及肉芽组织形成;关节腔有无减小或闭塞,关节软骨有无破坏或纤维化,关节周围皮下组织有无炎细胞浸润或纤维化,根据关节各部位病变轻重程度,依次定量为/1分(轻度或少量)0,/2分(中度或多量)0,/3分(重度或大量)0,/4分(极重度)0,无病变组织定为/0分0。关节周围皮下组织病变以半量计算。累加所有分数,得出总分,计算出每组每只动物的均分,分值越高提示损伤越严重,反之则说明经药物处理后损伤减轻,治疗有效。2.5 统计学处理所有数据均用x ?s表示,统计采用方差分析,对方差分析有显著差异者进一步用t检验比较组间差异。3 实验结果3.1 金雀根对大鼠佐剂关节炎评分

11、的影响 见表1。金雀根对大鼠佐剂性关节炎关节评分的影响( x?s)关节评分剂量/(g/kg体重)d10-2.51.250.6250.06P<0.01。0.00?0.008.47?1.115.21?0.92*6.08?1.07*7.11?0.88*5.41?0.74*d210.00?0.0013.08?1.56*8.25?1.11*7.18?1.0211.39?1.74*8.25?1.02*d280.00?0.0011.33?1.014.16?0.89*5.36?1.21*7.31?1.33*6.56?0.71*注:与模型组相比*P<0.05,*3.2 金雀根对佐剂性关节炎大鼠关节肿

12、胀度的影响 见表2。15092009年10月第31卷 第10期表2动物数分组模型组 金雀根高剂量组金雀根中剂量组金雀根低剂量组雷公藤多苷片组/只1010101010剂量/(g/kg体重)-2.51.250.6250.06*中成药ChineseTraditionalPatentMedicine金雀根对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀度( x?s)d2d6d10d14d18d20d24October2009Vo.l31 No.10d281.20?0.11*1.08?0.121.33?0.10*1.13?0.13*1.37?0.121.19?0.14*1.24?0.14*1.32?0.09*1.21?0.1

13、01.27?0.111.16?0.12*1.27?0.121.22?0.121.17?0.08*1.16?0.12*1.06?0.091.12?0.101.07?0.091.09?0.131.12?0.081.07?0.041.02?0.110.96?0.050.89?0.111.03?0.091.00?0.091.08?0.101.14?0.12*1.14?0.12*1.22?0.081.25?0.12*1.07?0.111.13?0.081.06?0.10*1.22?0.09*1.16?0.091.27?0.10*1.23?0.10*1.10?0.09*1.21?0.09注:与模型组比较,

14、*P<0.05,*P<0.01。3.3 金雀根对大鼠踝关节组织病理改变到多量炎细胞浸润,炎细胞以类上皮细胞为主,形成3.3.1 正常组 关节表面被覆薄层透明软骨,细胞排列整齐、关节面光滑,软骨内无血管和神经。关节囊由结缔组织构成,囊腔光滑,表面覆有14层滑膜细胞。软骨下为骨组织,由编织骨组成。关节周围由肌腱横纹肌结缔组织组成,表面被有复层鳞状上皮。1只关节滑膜有轻度充血,滑膜细胞有轻度变性,其余只各部位组织结构正常,未查见明显病理变化。3.3.2 模型组 关节滑膜:滑膜细胞有轻度到中度变性、中度增生,呈短绒毛状或指突状伸入关节腔内。滑膜有少量到多量炎细胞浸润、并有少量到多量肉芽组织

15、形成。关节腔:腔内未见炎性渗出物,但8只关节软骨有中度到重度破坏、表面有纤维结缔组织增生,5只纤维结缔组织增生明显,导致关节腔消失。周围软组织炎症反应:中度到重度炎细胞浸润,炎细胞以类上皮细胞为主,并形成风湿结节样病变,5只尚有中性粒细胞呈灶性集聚,形成局部小脓肿。3.3.3 金雀根高剂量组 关节滑膜:细胞轻度变性5只(5只/10只),6只滑膜细胞均有增生,轻度的表现为滑膜细胞层次增多,中度或重度增生时呈绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外5只滑膜有少量炎细胞浸润、其中2只有少量肉芽组织形成。关节腔:腔内未见炎性渗出物,但3只关节软骨有轻度到极重度破坏,表面有纤维结缔组织增生,其中2只,增生的纤维

16、结缔组织使相邻两个关节面黏连,导致关节腔消失。周围软组织炎症反应:中度到重度炎细胞浸润,炎细胞以类上皮细胞为主,并形成风湿结节样病变,外周有淋巴细胞浸润。3.3.4 金雀根中剂量组 关节滑膜:细胞轻度变性6只(6只/10只),滑膜细胞轻度增生4只(4只/10只),滑膜有少量炎细胞浸润3只(3只/10只)、其中2只有少量肉芽组织形成。关节腔:腔内未见炎性渗出物,但1只关节软骨有中度变性坏死,表面有纤维结缔组织增生。周围软组织炎症反应:有少量1510风湿结节样病变,外周有淋巴细胞浸润。3.3.5 金雀根低剂量组 关节滑膜:细胞轻度到重度变性5只(5只/10只),滑膜细胞均有中度和重度增生,呈长短不

17、一的绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外3只滑膜有少量到大量炎细胞浸润,其中5只有少量肉芽组织形成,外周有淋巴细胞浸润。关节腔:腔内未见炎性渗出物,但3只关节软骨有中度到重度破坏,表面有纤维结缔组织增生。周围软组织炎症反应:10只均有中度到重度炎细胞浸润,炎细胞以类上皮细胞为主,并形成风湿结节样病变,2只尚有中性粒细胞呈灶性集聚,形成局部小脓肿。3.3.6 雷公藤多苷片组 关节滑膜:细胞轻度到中度变性5只,7只滑膜细胞均有中度增生,呈较短绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外2只滑膜有少量到大量炎细胞浸润,其中2只有少量肉芽组织形成。关节腔:腔内未见炎性渗出物,但1只关节局部表面有轻度纤维结缔组织增生。

18、周围软组织炎症反应:病变不明显。3.4 各组佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理改变轻重程度的比较 见表3。表3金雀根对佐剂性关节炎大鼠关节病变轻重程度评分结果( x?s)组别动物数/只剂量/(g/kg)病变评分正常组 10-0.00?0.00模型组 10-13.56?1.04金雀根高剂量组102.56.41?1.32*金雀根中剂量组101.255.25?1.45*金雀根低剂量组100.62511.23?2.24雷公藤多苷片组100.067.56?1.09*注:与模型组比较,*P<0.01。3.5 结果对大鼠佐剂性关节炎的影响的实验结果显示:¹各给药组动物关节炎评分均低于模型组。金雀

19、根高、中剂量组关节炎评分明显低于模型组,金雀根三个剂量组和雷公藤多苷片组关节炎评分与模型组相比较,有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。表2009年10月第31卷 第10期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineOctober2009Vo.l31 No.10明金雀根对关节炎症有抑制作用,且能减少继发足的关节炎发生率。º同日内测定大鼠左足(造模足)足=踝体积,结果表明,金雀根高、中、低剂量组,雷公藤多苷片左足体积均小于模型组左足体积,与模型组相比,有显著性差异。金雀根高、中、低剂量组足跖体积均小于模型组,两者相比差异显著,表明金雀根有抑制

20、大鼠关节肿胀的作用。»大鼠造模后第6、10天,金雀根高、中剂量组关节肿胀度均小于模型组,与模型组相比,有显著性差异,表明金雀根对佐剂性关节炎大鼠关节肿胀有一定的抑制作床上因诸邪所偏重,治疗也有所偏重。另外,/久病入络0/痹久必瘀0,须注意活血化瘀通络。金雀根Caraganasinica(Bucchoz)Rehd.3属植物锦鸡儿根皮,生于山坡上,岸边草地、沙丘地与干燥坡地,广泛分布于东北、内蒙古、山西、陕西等地。味甘微辛,性平,归肺、脾、肾经,功能具有4健脾补肝益肾、祛风活血、止痛通脉、清肺补气的功效。在5本草纲目拾遗6:/治跌打损伤,咳嗽,暖筋骨,和血去风,兼通血脉,消结毒0,主治风

21、湿久痹,筋骨酸痛及半身不遂,虚损劳热等,配合五加皮、木瓜、桑叶用。¼金雀根高、中剂量组和雷公藤多苷片组的大鼠踝关节组织病理改变均有明显减轻,与模型组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01),金雀根高、中剂量组的大鼠踝关节组织病理改变明显较轻,与模型组相比差异显著,与正常组相比,模型组病变最重。由此可见,金雀根可明显减轻佐剂性关节炎大鼠足肿胀程度、踝关节组织病理改变,降低关节炎评分。4 讨论类风湿性关节炎主要病变在关节、筋骨,病因病机多为肝肾亏虚、正气不足,风寒湿热之邪侵袭,阻滞经络,气血运行不畅,久而为痹。5内经6中记载:/风寒湿三气杂至合而为痹0。多病程缠绵,久成顽痹,常出现以下变化:¹风寒湿痹或热痹日久不愈,气血运行不畅日甚,瘀血痰浊阻痹经络。º病久使气血耗伤,亦可出现不同程度的气血亏虚和肝肾不足的证候;»痹症日久不愈,复感于邪,病邪由经络而累及脏腑。临床主要表现为关节、肌肤、筋骨麻木、肿胀、疼痛、重着、屈伸不利,甚至僵直、畸形、活动障碍。在治疗RA时要注意以下两个方面:¹强调内因,扶正固本是根本,RA日久缠绵成为久痹、顽痹表现为遍身关节隐隐作痛,四肢麻