细胞生物学的研究方法学习教案

1、会计学1第一页，共166页。第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法Technology for Cell Biology第一节第一节第二节第二节第三节第三节中英文中英文退退 出出第四节第四节第五节第五节第六节第六节第1页/共166页第二页，共166页。一、光学显微一、光学显微(xin wi)镜技术镜技术二、电子显微二、电子显微(xin wi)镜技术镜技术三、纳米显微三、纳米显微(xin wi)技术技术四、超分辨光学显微四、超分辨光学显微(xin wi)技术技术退退 出出首首 页页Technology for Cell Biology第三章第三章 细胞细胞(xbo

2、)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第2页/共166页第三页，共166页。一、光学一、光学(gungxu)显显微镜技术微镜技术Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第3页/共166页第四页，共166页。一、光学一、光学(gungxu)显显微镜技术微镜技术不同不同(b tn)显微结构的尺寸显微结构的尺寸由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为

3、光学显微镜分辨糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。极限。Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第4页/共166页第五页，共166页。2.分辨率公式分辨率公式(gngsh)n = 聚光镜和物镜之间介质聚光镜和物镜之间介质(jizh)的折射的折射 率，空气为率，空气为1，油为，油为1.5。= 标本对物镜镜口张角的半角，标本对物镜镜口张角的半角， sin的最大值为的最大值为1。= 照明光源的波长，白光照明光源的波长，白光0.5 m 。横向横向(hn

4、 xin)分辨率分辨率 Rx,y=0.61/nsin 纵向分辨率纵向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法( (一一) )普通光学显微镜的分辨率普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第5页/共166页第六页，共166页。戊二醛戊二醛甲醛甲醛退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法( (一一) )普通普通(ptng)(ptng)光学显微镜的分辨率光学显微镜

5、的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第6页/共166页第七页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法( (一一) )普通普通(ptng)(ptng)光学显微镜的分辨率光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第7页/共166页第八页，共166页。组织切片制备组织切片制备(zhbi)过程过程退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第8页/共166页第九页

6、，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第9页/共166页第十页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、光学一、光学(gungxu)显微镜技术显微镜技术第10页/共166页第十一页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第11页/共166

7、页第十二页，共166页。荧光素荧光素(fluorescein)，绿色荧光绿色荧光四甲基罗丹明四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光红色荧光退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第12页/共166页第十三页，共166页。( (二二) )荧光显微镜可以呈现荧光显微镜可以呈现(chngxin)(chngxin)强反差的彩色图强反差的彩色图像像2.荧光荧光(ynggung)显微镜工作显微镜工作原理原理荧光荧光(ynggung)显微镜显微镜（fluorescence

8、microscope）的结构特点：）的结构特点： 以高压汞灯和弧光作为光源。以高压汞灯和弧光作为光源。两组滤光片。两组滤光片。荧光荧光(ynggung)显微显微镜的光学系统镜的光学系统退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第13页/共166页第十四页，共166页。( (二二) )荧光荧光(ynggung)(ynggung)显微镜可以呈现强反差的彩色图显微镜可以呈现强反差的彩色图像像3.应用应用成像反差强，检测灵敏度高。成像反差强，检测灵敏度高。 定性、定位定性、定位(dng

9、wi)和定量的研究组织内的荧光标和定量的研究组织内的荧光标记物质。记物质。对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第14页/共166页第十五页，共166页。( (三三) )相差显微镜通常被用于观察相差显微镜通常被用于观察(gunch)(gunch)活细胞活细胞波长变波长变化化振幅变振幅变化化光速变光速变化化颜色变化颜色变化明暗变化明暗变化相位变化相位变化人眼能感知人眼能感知人眼不

10、能感知人眼不能感知原理原理(yunl)：退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第15页/共166页第十六页，共166页。( (三三) )相差相差(xin ch)(xin ch)显微镜通常被用于观察活细显微镜通常被用于观察活细胞胞应用：活细胞应用：活细胞(xbo)观察观察退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第16页/共166页第十

11、七页，共166页。相差显微镜观察培养相差显微镜观察培养(piyng)中的中的HeLa细胞细胞退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第17页/共166页第十八页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第18页/共166页第十九页，共166页。原理：散射光成像。原理：散射光成像。应用应用(yngyng)(yngyng)：分辨率不：分辨率不高。高。适合观察活细胞内的细胞核、适合观

12、察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。和真菌等。 ( (四四) )暗视野显微镜通过暗视野显微镜通过(tnggu)(tnggu)散射光成像散射光成像暗视野显微镜工作暗视野显微镜工作(gngzu)原理原理退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第19页/共166页第二十页，共166页。( (五五) )显微电影摄影显微电影摄影(shyng)(shyng)技术记录细胞或细胞器的运动过技术记录细胞或细胞器的运动过程程 原理：用显微电影摄影原理：用

13、显微电影摄影(shyng)(shyng)术或电视录像以一定时间间术或电视录像以一定时间间隔拍摄。隔拍摄。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法一、光学一、光学(gungxu)显显微镜技术微镜技术第20页/共166页第二十一页，共166页。原理：原理：单色激光作为光源。单色激光作为光源。共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以

14、外发出的光线聚焦成像，焦面以外(ywi)(ywi)的漫射光的漫射光不参加成像。不参加成像。逐点扫描。逐点扫描。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第21页/共166页第二十二页，共166页。应用：进行应用：进行(jnxng)(jnxng)连续的光学切片，通过电脑进连续的光学切片，通过电脑进行行(jnxng)(jnxng) 三维重建。三维重建。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xb

15、o)生物学研究方法生物学研究方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术第22页/共166页第二十三页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第23页/共166页第二十四页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第24页/共166页第二十五页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学

16、研究(ynji)(ynji)方法方法第25页/共166页第二十六页，共166页。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第26页/共166页第二十七页，共166页。(一一)透射透射(tu sh)电子显微镜（电子显微镜（transmission electron microscope，TEM ）光学显微镜与透射光学显微镜与透射(tu sh)电子显微镜的比较电子显微镜的比较退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三

17、章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第27页/共166页第二十八页，共166页。( (一一) )透射透射(tu sh)(tu sh)电子显微镜电子显微镜退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第28页/共166页第二十九页，共166页。( (一一) )透射透射(tu sh)(tu sh)电子显微镜电子显微镜退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三

18、章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第29页/共166页第三十页，共166页。科学(kxu)Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第30页/共166页第三十一页，共166页。科学(kxu)Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生

19、物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第31页/共166页第三十二页，共166页。扫描电镜的工作扫描电镜的工作(gngzu)原理原理 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第32页/共166页第三十三页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第33页/共166页第三十四页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章

20、第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第34页/共166页第三十五页，共166页。( (三三) )透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取蚀刻技术可获取(huq)(huq)三维图像三维图像1.金属投影法（金属投影法（metal shadowing） 原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示 投影效果，给出样品表面三维结构。投影效果，给出样品表面三维结构。 应用：观察蛋白、核酸应用：观察蛋白、核酸(h sun)类大分子，病毒颗粒及细类大分子，病毒颗粒及细胞壁胞壁

21、 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第35页/共166页第三十六页，共166页。2.冰冻冰冻(bngdng)断裂（断裂（freeze-fracture） 样品快速冷冻样品快速冷冻 冰刀从脂双层疏水部分撬开冰刀从脂双层疏水部分撬开 暴露膜内部构造暴露膜内部构造 样品样品(yngpn)制制备：备：应用：观察细胞膜性结构应用：观察细胞膜性结构(jigu)(jigu)的内部构造。的内部构造。 退退 出出Technology for Cell Biology首

22、首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第36页/共166页第三十七页，共166页。2.冰冻冰冻(bngdng)断裂（断裂（freeze-fracture） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)第37页/共166页第三十八页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第

23、38页/共166页第三十九页，共166页。3.冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze-etch）冷冻组织冷冻组织 冰刀撬组织冰刀撬组织 真空中升华真空中升华 暴露膜结构暴露膜结构 应用：观察应用：观察(gunch)细胞的内部细胞的内部构造。构造。 样品样品(yngpn)制备：制备：退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术第39页/共166页第四十页，共166页。3.冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze-etch）退退 出出Technology for Cell Bi

24、ology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)第40页/共166页第四十一页，共166页。冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白(dnbi)(dnbi)纤维纤维退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第41页/共166页第四十二页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynj

25、i)方法方法第42页/共166页第四十三页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第43页/共166页第四十四页，共166页。1.扫描扫描(somio)隧道显微镜（隧道显微镜（scanning tunneling microscope,STM）原理：使用原子尺度的探针在标本原理：使用原子尺度的探针在标本(biobn)(biobn)的表面进行扫的表面进行扫描，在探针描，在探针 针尖和样品间施加一定电压，产生随标本针尖和样品间施加一定电压，产生随标本(biobn)(biobn)

26、表面形貌变表面形貌变 化的隧道电流。化的隧道电流。特点：分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作。特点：分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作。 应用：直接观察大分子的三维结构，如应用：直接观察大分子的三维结构，如DNADNA双螺旋结构双螺旋结构 。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法 三、纳米显微技术三、纳米显微技术第44页/共166页第四十五页，共166页。1.扫描扫描(somio)隧道显微镜（隧道显微镜（scanning tunneling microscope,STM）扫描

27、隧道显微镜下的人红细胞血影退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法 三、纳米显微三、纳米显微(xin wi)技术技术第45页/共166页第四十六页，共166页。2.原子力显微镜（原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）原理：通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获原理：通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所取所 观察表面的微观信息。观察表面的微观信息。 特点：可以在三态（固态、气态和液态）特点：可以在三态（固态、气态和液态） 状况下工作。状况下

28、工作。应用：活细胞表面及生物大分子应用：活细胞表面及生物大分子(fnz)空间伸展及其结晶空间伸展及其结晶体表面观测体表面观测 进行单个分子进行单个分子(fnz)操作。操作。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法 三、纳米三、纳米(n m)显微技术显微技术第46页/共166页第四十七页，共166页。2.原子力显微镜原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）针尖的曲率半径通常为针尖的曲率半径通常为5-10nm5-10nm退退 出出Technology for Cel

29、l Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法 三、纳米三、纳米(n m)显微技术显微技术第47页/共166页第四十八页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第48页/共166页第四十九页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第49页/共166页第五十页，共166页。由光的衍射效应导致的光学显微镜分

30、辨率极限由光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限(jxin)称称 为为Abbe限度限度(Abbe limit)。应用新的光学原理、发光应用新的光学原理、发光/示踪分子和信号分析示踪分子和信号分析 技术，建立起了能够突破技术，建立起了能够突破Abbe限度的超分辨显限度的超分辨显 微技术，使光学显微镜的分辨率达到了微技术，使光学显微镜的分辨率达到了3050nm 的纳米尺度。的纳米尺度。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第50页/共166页第五十一页，共166页。光的衍射效应使物镜的焦点呈

31、椭圆形光的衍射效应使物镜的焦点呈椭圆形(左左)；当两点间的距离大于衍射限；当两点间的距离大于衍射限度时，物镜能够呈现度时，物镜能够呈现(chngxin)两个像，如两根微管的横切面两个像，如两根微管的横切面A；当；当两点间的距离小于衍射限度时，物镜不能够呈现两点间的距离小于衍射限度时，物镜不能够呈现(chngxin)两个像，两个像，如两根微管的横切面如两根微管的横切面B。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第51页/共166页第五十二页，共166页。STED显微技术成像与共焦显微技术成

32、像与共焦显微技术成像比较显微技术成像比较以线粒体膜蛋白以线粒体膜蛋白TOM20为为标志蛋白，左上为共焦显标志蛋白，左上为共焦显微镜呈现的线粒体结构微镜呈现的线粒体结构(jigu)，右上为，右上为STED显显微镜呈现的线粒体结构微镜呈现的线粒体结构(jigu)。左下为。左下为TOM2和和线粒体基质蛋白线粒体基质蛋白HSP70在在共焦显微镜下呈现的线粒共焦显微镜下呈现的线粒体结构体结构(jigu)。右下为由。右下为由STED技术重建的线粒体三技术重建的线粒体三维结构维结构(jigu)。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研

33、究(ynji)(ynji)方法方法第52页/共166页第五十三页，共166页。SIM显微技术显微技术(jsh)成像成像与共焦显微技术与共焦显微技术(jsh)成成像比较像比较将核孔复合体标记成红色，将核孔复合体标记成红色，核纤层蛋白核纤层蛋白B标记成绿色、标记成绿色、DNA标记成蓝紫色，用共标记成蓝紫色，用共焦显微镜呈现的细胞核中焦显微镜呈现的细胞核中间位置横切面结构，小图间位置横切面结构，小图为方框内的细微结构为方框内的细微结构(上上)；相同方法标记细胞核，相同方法标记细胞核，SIM技术技术(jsh)三维重建三维重建后呈现的细胞核中间位置后呈现的细胞核中间位置横切面结构。横切面结构。退退 出出

34、Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第53页/共166页第五十四页，共166页。第二节第二节 细胞的分离细胞的分离(fnl)(fnl)和培养和培养 一、细胞分离一、细胞分离二、细胞培养二、细胞培养离心方法离心方法 流式细胞术流式细胞术 免疫磁珠法免疫磁珠法 激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第54页/共166页第五十五页，共166页。一、不同一

35、、不同(b tn)类型细胞类型细胞的分离的分离胰蛋白酶、胶原酶胰蛋白酶、胶原酶EDTA消除细胞间的连消除细胞间的连接和细胞外基质接和细胞外基质 细胞分离需根据细胞分离需根据(gnj)不同细胞的特征采用不同不同细胞的特征采用不同的方法。的方法。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第55页/共166页第五十六页，共166页。一、不同类型细胞一、不同类型细胞(xbo)的分离的分离( (一一) )离心方法离心方法 利用细胞的密度利用细胞的密度(md)(md)特性可有效分离不同的细胞。如特性可有效分离不同的细胞。如

36、血浆白细胞和红细胞的分离。血浆白细胞和红细胞的分离。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第56页/共166页第五十七页，共166页。流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytometer）：从多细胞悬）：从多细胞悬 液中分离目的液中分离目的(md)细胞的精密仪器。细胞的精密仪器。 样品处理：用带有荧光的特异抗体标记待分离样品处理：用带有荧光的特异抗体标记待分离 的细胞。的细胞。分离速度：分离速度：2万个细胞万个细胞/s 。 分离纯度：分离纯度：95% 。( (二二) )流式细胞术流式

37、细胞术退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同类型一、不同类型(lixng)细胞细胞的分离的分离第57页/共166页第五十八页，共166页。( (二二) )流式细胞术流式细胞术Beckman FC500 流式细胞仪外形流式细胞仪外形(wi xn)流式细胞仪工作流式细胞仪工作(gngzu)原理原理退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的

38、分离第58页/共166页第五十九页，共166页。Beckman FC500 流式细胞仪分析流式细胞仪分析(fnx)结果结果退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第59页/共166页第六十页，共166页。( (三三) )免疫免疫(miny)(miny)磁珠法磁珠法 利用带有特定单抗的免疫利用带有特定单抗的免疫(miny)磁珠磁珠（immunomagnetic microsphere）与靶细胞的特异结）与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。合，快速地从多细胞悬液中将目的细

39、胞分离出来。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同类型细胞的分离一、不同类型细胞的分离第60页/共166页第六十一页，共166页。( (三三) )免疫免疫(miny)(miny)磁珠法磁珠法 分离分离(fnl)纯度：纯度：9599 Fe2O3或或Fe3O4颗粒颗粒 + 单克隆抗体单克隆抗体 免疫磁珠免疫磁珠退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法一、不同类型细胞的分离一、不

40、同类型细胞的分离第61页/共166页第六十二页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法一、不同一、不同(b tn)类型细胞类型细胞的分离的分离第62页/共166页第六十三页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同一、不同(b tn)类型细胞类型细胞的分离的分离第63页/共166页第六十四页，共166页。退退 出出Technology for Cell

41、 Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第64页/共166页第六十五页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第65页/共166页第六十六页，共166页。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第66页/共166页第六十七页，共166页。CO2培养箱CO2培养箱相差显微镜超净工作台退退 出出Technology fo

42、r Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第67页/共166页第六十八页，共166页。2.原代培养原代培养(piyng)和传代培养和传代培养(piyng)原代培养原代培养(piyng)（primary culture）：直接取）：直接取材于有机材于有机 体组织的细胞培养体组织的细胞培养(piyng)。传代培养传代培养(piyng)（secondary culture）：原代）：原代培养培养(piyng)的细的细 胞从培养胞从培养(piyng)瓶中取出，以瓶中取出，以1:2以上的以上的比例的扩比例的扩 大培养大培养(piyng

43、)。传代培养。传代培养(piyng)的细的细胞通常表现出其来源胞通常表现出其来源 组织的分化特征。组织的分化特征。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法 二、细胞培养二、细胞培养第68页/共166页第六十九页，共166页。3.细胞系细胞系细胞系（细胞系（cell line）：在培养）：在培养(piyng)的细胞中产生的细胞中产生“不死不死”的的 变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。细胞系的来源包括培养细胞系的来源包括培养(piyng)过程中发生转

44、化的正常细胞和过程中发生转化的正常细胞和取材于肿瘤组织的原代培养取材于肿瘤组织的原代培养(piyng)细胞。细胞。细胞株（细胞株（cell strain）：用细胞克隆化的方法进一步改）：用细胞克隆化的方法进一步改 善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖 形成的细胞群。形成的细胞群。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法 二、细胞培养二、细胞培养第69页/共166页第七十页，共166页。一、细胞裂解一、细胞裂解二、细胞器及细胞组分的分级离心二、细

45、胞器及细胞组分的分级离心三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定四、核酸四、核酸(h sun)的分离纯化与鉴定的分离纯化与鉴定退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第70页/共166页第七十一页，共166页。一、细胞一、细胞(xbo)(xbo)裂解裂解在细胞组分的分级离心前，首先破碎细胞，制备细胞匀在细胞组分的分级离心前，首先破碎细胞，制备细胞匀浆液。浆液。方法：方法： 低渗透压；低渗透压； 超声振荡；超声振荡； 强制通过强制通过(tnggu)微孔；微孔； 机械破碎及研磨；机械破碎及研

46、磨； 去垢剂：如去垢剂：如SDS、TritonX-100、NP-40 常用于蛋白质的抽提；常用于蛋白质的抽提； 离液剂：如盐酸胍、尿素离液剂：如盐酸胍、尿素 常用于细胞常用于细胞DNA和和RNA的抽提。的抽提。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第71页/共166页第七十二页，共166页。二、细胞器及细胞组分的分级二、细胞器及细胞组分的分级(fn (fn j)j)离心离心 (一一)差速离心差速离心（differential centrifugation）方法：从高速到低速逐级沉降。方法

47、：从高速到低速逐级沉降。分离分离(fnl)对象：体积、质量差别对象：体积、质量差别较大较大 的颗粒的颗粒 。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第72页/共166页第七十三页，共166页。(二二)速度沉降（速度沉降（velocity sedimentation）方法：在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加方法：在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加 的蔗糖的蔗糖(zhtng)溶液密度梯度溶液密度梯度(通常通常5%20%)。分离对象：沉降系数不同的颗粒。分离对象：沉降系数不同的颗粒。 退退 出出T

48、echnology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、细胞器及细胞组分的分级二、细胞器及细胞组分的分级(fn (fn j)j)离心离心 第73页/共166页第七十四页，共166页。(三三)平衡沉降（平衡沉降（equilibrium sedimentation） 方法：在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的方法：在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的 蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。蔗糖或氯化铯溶液密度梯度。 分离分离(fnl)对象：密度不同颗粒。对象：密度不同颗粒。退退 出出Technology for Cell Biol

49、ogy首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法二、细胞器及细胞组分二、细胞器及细胞组分(zfn)(zfn)的分级的分级离心离心 第74页/共166页第七十五页，共166页。速度速度(sd)沉降沉降(A)和平衡沉降和平衡沉降(B)离心离心的比较的比较 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法二、细胞二、细胞(xbo)(xbo)器及细胞器及细胞(xbo)(xbo)组组分的分级离心分的分级离心 第75页/共166页第七十六页，共166页。(四四)非细

50、胞体系非细胞体系 (cell free system) 1. 概念概念非细胞体系是指从分级分离得到的具有生物非细胞体系是指从分级分离得到的具有生物(shngw)功能的细胞抽提物。功能的细胞抽提物。2. 应用应用将某个生物将某个生物(shngw)过程与细胞中发生的其他复过程与细胞中发生的其他复杂的反应分割开来，从而确定其详细的分子机制，杂的反应分割开来，从而确定其详细的分子机制，研究各种细胞器及细胞成分的功能。研究各种细胞器及细胞成分的功能。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法二、细胞二

51、、细胞(xbo)(xbo)器及细胞器及细胞(xbo)(xbo)组组分的分级离心分的分级离心 第76页/共166页第七十七页，共166页。三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定(一一)柱层析（柱层析（column chromatography） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法第77页/共166页第七十八页，共166页。1.离子交换层析离子交换层析 填充基质：离子交换树脂。填充基质：离子交换树脂。 分离原理：电荷不同分离原理：电荷不同(b tn)。2.凝胶过滤层析凝胶过

52、滤层析 填充基质：多孔性凝胶颗粒。填充基质：多孔性凝胶颗粒。 分离原理：大小不同分离原理：大小不同(b tn)。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定(一一)柱层析（柱层析（column chromatography） 第78页/共166页第七十九页，共166页。3.疏水性层析疏水性层析 填充基质：带有疏水性基团的颗粒。填充基质：带有疏水性基团的颗粒。 分离原理：疏水性不同。分离原理：疏水性不同。4.亲和层析亲和层析 填充基质：结合填充

53、基质：结合(jih)有酶底物、特异性抗体或抗有酶底物、特异性抗体或抗原的颗粒。原的颗粒。 分离原理：亲和性不同。分离原理：亲和性不同。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定(一一)柱层析（柱层析（column chromatography） 第79页/共166页第八十页，共166页。 三种三种(sn zhn)(sn zhn)层析用的基质层析用的基质 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章

54、细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第80页/共166页第八十一页，共166页。(二二)高效高效(o xio)液相层析（液相层析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）填充基质：填充基质：310 m的微小球型树脂。的微小球型树脂。 特点：分离特点：分离(fnl)速度快、分离速度快、分离(fnl)度高。度高。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定第81页/共166页第八十二

55、页，共166页。( (二二) )高效高效(o xio)(o xio)液相层析液相层析高效液相分子筛色谱测定高效液相分子筛色谱测定(cdng)纯化蛋白的纯化蛋白的分子量分子量退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定第82页/共166页第八十三页，共166页。( (三三) ) 蛋白质电泳蛋白质电泳(din (din yn)yn)蛋白质带有净电荷，具有不同形状蛋白质带有净电荷，具有不同形状(xngzhun)、大小以、大小以及净电荷的蛋白质分子在电场中会产

56、生不同的迁移速率，及净电荷的蛋白质分子在电场中会产生不同的迁移速率，进而被分离。进而被分离。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定第83页/共166页第八十四页，共166页。(三三) 蛋白质电泳蛋白质电泳(din yn)1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS polyacrylamid gel electrophoresis ， SDS-PAGE）支持支持(zhch)体：聚丙烯酰胺。体：聚丙烯酰胺。样品处理：样品处理： SDS还

57、原剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇还原剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇 分离原理：依据分子量的不同分离蛋白质。分离原理：依据分子量的不同分离蛋白质。 所有蛋白质带有所有蛋白质带有负电荷，呈伸展负电荷，呈伸展的多肽链的多肽链 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法三、蛋白质的分离与鉴定三、蛋白质的分离与鉴定第84页/共166页第八十五页，共166页。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细

58、胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法第85页/共166页第八十六页，共166页。2.等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusing）电泳）电泳 支持体：丙烯酰胺凝胶。支持体：丙烯酰胺凝胶。条件：两性电解质在电场当中形成条件：两性电解质在电场当中形成pH梯度梯度(t d)。分离原理：依据等电点不同分离蛋白质。分离原理：依据等电点不同分离蛋白质。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定第86页/共166页

59、第八十七页，共166页。2.等电聚焦等电聚焦(jjio)（isoelectric focusing）电泳）电泳 退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞生物学研究细胞生物学研究(ynji)(ynji)方法方法三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定第87页/共166页第八十八页，共166页。3.双向电泳双向电泳 原理：等电聚焦与原理：等电聚焦与SDS-PAGE结合结合 。在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳 。将凝胶条横放于聚合好的平板将凝胶条横放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝胶上丙烯酰胺凝胶上

60、进行垂直电泳进行垂直电泳 。应用：可一次分离应用：可一次分离(fnl)数千种蛋白。数千种蛋白。退退 出出Technology for Cell Biology首首 页页第三章第三章 细胞细胞(xbo)(xbo)生物学研究方法生物学研究方法三、蛋白质的分离三、蛋白质的分离(fnl)与鉴定与鉴定第88页/共166页第八十九页，共166页。四、核酸的分离纯化四、核酸的分离纯化(chn hu)(chn hu)与鉴定与鉴定( (一一) )差速离心沉淀是核酸分离纯化的主要差速离心沉淀是核酸分离纯化的主要(zhyo)(zhyo)方法方法 DNA还是还是RNA，它们在细胞中总是与蛋白，它们在细胞中总是与蛋白