放射损伤对外源骨髓间充质干细胞迁徙定植的影响

1、放射损伤对外源骨髓间充质干细胞迁徙定植的影响    【摘要】  研究机体中枢神经系统受放射损伤时骨髓间充质干细胞（）的迁徙定植特性的改变，从而为应用治疗中枢神经系统放射损伤提供理论和实验依据。 【方法】用周龄大鼠接受线照射制作枢神经系统放射损伤模型；从鼠抽取骨髓，分离和扩增。中枢神经系统受放射损伤的大鼠个月后予静脉输注-。于移植后几个时间点取脑、骨髓、肝、脾等做冰冻切片，用双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜检测-。 【结果】在最早内实验组和对照组的骨髓中检测到外源性阳性细胞，至第天后实验组骨髓中阳性细胞显著多于对照组。脑内第天未检测到外源性阳性细胞

2、，第天后中枢神经系统受放射损伤的大鼠，脑组织检测到带绿色荧光的外源性阳性细胞；而对照组脑内一直未检测到带绿色荧光的外源性。实验组和对照组脾脏在输注后第天即检测到大量阳性细胞，并持续存在，第天实验组阳性细胞较对照组减少。【结论】在放射损伤条件下外源性可透过血脑屏障到达脑组织，中枢神经系统放射损伤可诱导外源性向脑组织迁徙定植。 【关键词】  放射损伤 中枢神经系统 骨髓间充质干细胞 ： 【】 （） ， （） 【】 - - - （） ， ， ， 【】 ， ， 【】 - ： ； ； 随着干细胞工程研究的深入， 细胞替代治疗已成为治疗损伤、遗传缺陷性或退行性疾病的新途径。骨髓间充质干细胞（ ，

3、） 是目前备受关注的一类来源于骨髓单个核细胞群，具有多向分化潜能的组织干细胞。特性稳定，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下， 可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等多种细胞-。作为神经系统疾病细胞治疗的供体细胞应容易获得，能够迅速扩增，能够在宿主脑内长期存活，易于外源基因的转染和长期表达，。其中骨髓细胞是可能的来源之一。有实验表明，骨髓单个核细胞能够穿过血脑屏障，而且有助于小胶质细胞的正常转化。而在中枢神经受损伤的状态下，外源在体内的移行和定植特性尚未有研究报道。本文观察到机体中枢神经系统受放射损伤状态下的一些迁徙定植特性，可能为应用治疗中枢神经系统放射损伤和其

4、他损伤提供实验依据。   材料与方法   实验动物与试剂   实验动物 健康雄性-大鼠只，平均体质量 ，随机分放射实验组和对照组，每组分个时间点。绿色荧光蛋白鼠只，平均体质量 ，作供体。实验动物均源自英国牛津大学实验动物部。   实验试剂 含 胎牛血清的（公司）、胰蛋白酶、抗单抗、抗单抗、抗单抗、抗单抗（公司）、碘化丙啶（公司）。   主要仪器 双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜（ - - ）（公司）、 冷冻切片机（公司）、实验线照射仪-（公司）、培养箱（公司）。   骨髓间充质干细胞分离与诱导   的原代培养 无菌条件下取绿色

5、荧光蛋白鼠股骨骨髓，加入含有 的肝素液的离心管中，充分混匀。加入适量液混匀，以 （ ） 离心 ，吸净上液；再用液洗一遍（方法同前），用含胎牛血清的完全培养液悬浮细胞，将其接种在 培养瓶中， 、体积分数、饱和湿度的培养箱中原代培养。倒置相差显微镜下每日观察次。原代（）约贴壁细胞接近融合时，用冲洗次以除去培养瓶中的含血清培养基。以适量 胰蛋白酶-室温消化 （冬季室温较低，可放入温箱 孵育），倒置相差显微镜下观察，见到细胞变圆、间隙增宽、有部分细胞悬浮时即可加入含有血清的完全培养基终止消化。并用吸管轻轻吹打，使细胞进一步脱落。将细胞悬液移入无菌离心管中，以 离心 ，弃去上清，加入适量完全培养基悬浮细

6、胞，将细胞悬液以 接种于塑料培养瓶中，置培养箱中继续培养。即为细胞代。待代细胞生长融合达时，可继续传代。   的鉴定 培养至代时，约贴壁细胞接近融合时，用洗次除去培养瓶中含血清的培养基，以适量胰蛋白酶-室温消化 倒置相差显微镜下观察，见到细胞变圆、间隙增宽、有部分细胞悬浮时即可加入含有血清的完全培养基终止消化。并用吸管轻轻吹打，使细胞进一步脱落。用洗次后送流式细胞仪室检测、。      放射损伤 只雄性鼠在周龄随机分成组：实验组 脑局部接受线照射；对照组作假照射。在乙醚麻醉下，实验组以的放射速率，接受 的线照射，线透过一个在 厚铅板上

7、直径的孔，保证大脑、小脑和脑干均接受线照射，而其他部位免于线照射。该方法可以导致胼胝体、内囊等在照射后 周间发生迟发性坏死。   间充质干细胞移植与检测 取扩增第代的，去掉培养液，洗遍，用 的 的胰蛋白酶和 混合液消化，用含 的洗涤后制成浓度为 × 的单细胞悬液。每只实验鼠和对照鼠在周龄时（即放射处理后周），从尾静脉注入细胞悬液 ，细胞数 × 。 移植后分别在第天、第天、第天、第天、第天将只实验鼠和对照鼠处死，取脑、肝、脾、肾、骨髓，标本置液氮后作冰冻切片，检测-在各组织的分布情况。切片以碘化丙啶染色（），用甘油封片，为减少荧光物质的光漂白作用，用双光子共聚焦红外

8、脉冲激光显微镜（ - ）检测。 结 果   的鉴定结果 培养至代的 生长旺盛、贴壁良好、呈均匀一致的旋涡状，移植前取 细胞悬液用流式细胞仪检测细胞表面标志显示、阳性，、阴性。   放射损伤结果 对实验组以 的放射速率进行线照射，造成海马和内囊变性。组织学检查显示，与对照组比较，实验组海马变性、神经元减少。   间充质干细胞移植后迁徙和定植情况 移植后分别在第天、第天、第天、第天、第天，取脑、肝、脾、肾、骨髓，作冰冻切片，用双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜检测-在各组织的分布情况，每个样本数个视野阳性细胞数，计算其平均值。结果显示：实验组和对照组在输注后第天脑内均未检

9、测到绿色荧光阳性的外源性阳性细胞。移植后第天实验组海马出现阳性细胞，第天最为明显；而对照组脑组织中未见有阳性细胞（图），经秩和检验，两组差异有显著性。实验组和对照组在移植后第天脾脏组织中出现大量的阳性细胞，并且一直持续至，在第天对照组脾脏阳性细胞明显高于实验组，经检验差异有显著性。实验组和对照组骨髓均在移植后第天即出现阳性细胞，但实验组多于对照组，经检验，在第天、第天、第天两组差异有显著性意义。肝脏在输注后第天即在实验组和对照组出现阳性细胞，之后各时间点均见阳性细胞，且实验组和对照组间差异无统计学意义（?）。肾脏仅在第天时间点出现阳性细胞，且两组间差异无统计学意义（?，表）。 讨 论 神经元的

10、特性决定了神经元在损伤坏死后难以再生。随着细胞移植研究的不断深入和应用，细胞替代治疗已成为治疗损伤、遗传缺陷性或退行性疾病的新途径，使神经组织的再生成为可能。以往在神经领域的细胞移植研究多数用相应神经部位的直接注射，这种方法在动物实验有较好的可行性，但在临床应用时有很大的局限性和危险性。有实验表明，骨髓单个核细胞能够穿过血脑屏障。根据这一特性，应用外周移植治疗中枢神经系统损伤存在着可能。本文在原有对放射性脑损害研究的基础上，观察中枢神经放射损伤对外周移植后迁徙定植特性的影响。   外源性的迁徙 本研究显示在输注-后内，实验组和对照组骨髓中均检测到阳性细胞，推测性可以直接向骨髓迁徙。比

11、较放射照射组和对照组脑内阳性细胞可反映出外源性在中枢神经放射损伤下的迁徙特性。结果显示：放射照射组在外周输注-后第天在海马区检测到-，第天最为明显；而未受到放射照射的对照组，移植后脑内一直未检测到外源的阳性细胞。可见，一方面外源性有穿过血脑屏障的能力，这与以往文献报道相符，但在对照组未见有外源性穿过血脑屏障到达脑组织，这说明只有在损伤等因素改变了血脑屏障特性使之一定程度开放的前提下，外源性才能穿过血脑屏障；另一方面，观察到外源性穿过血脑屏障后有向病损部位定向迁徙的特性。和把成年雄性小鼠的骨髓或反转录病毒载体标记的骨髓移植给亚致死量放射线照射的雌性小鼠， 后便在受体雌鼠的脑内发现供体骨髓来源的神

12、经细胞， 以后供体骨髓来源的神经细胞逐渐增多。原位杂交和免疫组化法检测发现，供体骨髓来源的神经细胞表达小胶质细胞和星形胶质细胞的特异性标志。等研究显示基质源因子-（-）有促进向受损组织迁徙的作用。   外源性的定植 外源性在受体内的定植很大程度上决定于其在骨髓的定植情况。本研究显示：与对照组比较，实验组骨髓中外源阳性细胞明显增多。可见放射损伤有诱导外源性在骨髓的定植作用，其机理尚未明了，可能在放射损伤时存在趋化因子受体（）的高表达，而后者有促进向骨髓中迁徙融合的作用，。此外，实验组和对照组从移植后第天，脾脏均见大量-，两组无差异。这种现象一直持续至第天，两组脾脏仍可见大量-。可见，外源性移植后大量细胞将在脾脏被清除，而且这一状态一直持续，这关乎着外源细胞的永久定植的可能性。比较一致的研究结果是移植后具有免疫耐受性不会引起宿主的免疫排斥反应。有报道表明， 和细胞均表达组织相容性复合物而缺乏组织相容性复合物，免疫原性较弱。但异体在受体内的远期归宿仍然没有定论。本研究显示实验组和对照组在各时间点都有大量-在脾脏持续存在，这是否是在受体中的归宿有待进一步研究。而在第天实验组脾脏中-较对照组显著减少，这是否提示经放射处理的大鼠在输注后，其后期的廓清减少而有利于定植？这一现象值得关注。 【参考文献】  ， ，