斑点酶联免疫吸附试验在诊断滴虫性阴道炎的临床应用

1、    斑点酶联免疫吸附试验在诊断滴虫性阴道炎的临床应用          摘要： 目的探讨不受温度影响且较准确诊断滴虫性阴道 炎的方法。方法采用斑点酶联免疫吸附试验。结果 检测108例经生理盐水涂片法检查滴虫阳性者标本，其抗体阳性率为92.5%，检 测真菌阳性者标本55例，滴虫抗体阳性率为0。结论斑点酶联免疫 吸附试验是一种灵敏度高、重复性好、特异性强、不受温度影响的诊断滴虫性阴道炎的方法 。关键词： 阴道滴虫； 抗体； 免疫酶技术中分类号： R382.2+1文献

2、标识码： B文章编号： 1005-4529(2000)06-0476-02为了探讨滴虫性阴道炎的诊断方法，我们采用以硝酸纤维膜 为固相载体的斑点酶联免疫吸附试验1，并与常用的免疫方法作了比较，现将结 果报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1标本取自1996年12月1998年12月我院妇产科门诊 患者阴道分泌物，按妇科检查常规，所用器械均经高温消毒灭菌，在窥器下用消毒棉签取阴 道后穹隆分泌物。经生理盐水涂片法检查阴道毛滴虫滋养体阳性者共108例，阴性者108例 ，真菌性阴道炎55例。标本稀释后4储用。1.1.2抗原取阴道毛滴虫阳性阴道分泌物标本接种于半胱 氨酸-蛋白胨-肝浸液-麦芽糖(CPL

3、M)(pH 6.0)的培养基中，3748 h转种，34代后为纯 培养，反复洗涤，收集纯净虫体，冻融，超声粉碎，以3?500 rmin，4下离心35 min， 收集上清液，测定其蛋白质浓度，低温储用。1.1.3抗体羊抗人IgG按郭春祥2辣根过氧化物 酶标记抗体的过碘酸钠法进行标记。1.1.4底物将10 mg的3-氨基-9-2基咔唑(AEC)加入3.0 ml二甲基甲酰胺中，临用时加入0.05 moll pH5.0醋酸缓冲液50 ml和3%H2O 2 0.2 ml。1.2斑点酶联免疫吸附试验操作程序1.2.1诊断膜制备先将硝酸纤维膜划分为3 mm×3 mm的小格，将抗原打点于格内，每点1

4、l，室温晾干，封闭液(Tris, NaCl, ED TA, Tween-20，小牛血清)封闭1 h，室温干燥，低温贮用。1.2.2与抗体作用将诊断膜直接浸入待检分泌物(本实验 的工作浓度为130)，室温下90 min。用0.02 molL pH7.2的磷酸盐-Tris缓冲液(PBST) 充分洗涤5次，每次3 min。1.2.3与酶标二抗作用将上述诊断膜浸入工作 浓度的酶标羊抗人IgG中，室温反应60 min，用PBST充分洗涤，方法同上。1.2.4中止反应将充分洗涤过的诊断膜浸入底物溶液中， 室温作用23 min，待阳性对照出现棕红色圆斑时，用自来水中止反应。1.2.5结果判定若待检标本斑点颜

5、色深于阳性对照，即为 阳性反应；若待检标本斑点颜色近于或浅于阴性对照的斑点颜色，即为阴性反应。1.3间接荧光法1.3.1抗原片制作培养之虫体计数后，滴于载玻片上圆圈 内，自然干燥后，置冷丙酮中固定10 min，再置入3%H2O2中浸泡30 min后， 用pH 7.4 0.01molL磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，干燥后，低温贮用。1.3.2与抗体作用低温中取出抗原片，室温平衡，滴加受 试标本，室温下90 min洗涤(洗涤液同斑点酶联法)。1.3.3与二抗作用加入工作浓度的荧光抗体，室温作用60 min，洗涤。与二抗作用后加11000的伊文思蓝15 min，洗涤，干后滴加缓冲甘 油封片。荧光镜

6、下观察：原虫呈红色、无荧光为阴性，原虫细胞质荧光明亮为强阳性(+)。 1.4常规酶联免疫吸附试验法1.4.1包被抗原40孔聚苯乙烯酶标板内包被已用pH 9.6碳 酸盐缓冲液稀释的抗原100 l，4过夜，次日甩干，洗涤(洗涤液同斑点酶联法)，10%小 牛血清封闭，洗涤。1.4.2与抗原作用加入待检样品，室温下90 min洗涤。1.4.3与二抗作用加入酶标二抗体，室温作用60 min洗涤 。加入底物AEC，肉眼观察色变，反应孔不出现颜色为阴性；反应孔玫瑰红色为阳性(+)；反 应孔红棕色为强阳性(+)。2结果2.1斑点酶联法检测阴道滴虫抗体结果用斑点酶 联法检测了271例阴道分泌物标本，其中生理盐水

7、涂片阳性者108例，阴性者108例，真菌性 者55例，见表1。表1斑点酶联法检测阴道毛滴虫抗体结 果组别n滴虫抗体阳性例数阴性例数滴虫阳性者1081008滴虫阴性者1081692真菌性者55055     2.2斑点酶联法与其他方法比较取阳性及阴性对 照标本作1120、1240、1480连续倍比稀释，同时做间接荧光、常规酶联及斑点酶联法 。结果常规酶联所能检测到的最高稀释度为160，间接荧光法为1240，斑点酶联法为1 480。3讨论滴虫性阴道炎是妇科常见病，近几年有增高趋势，其传播途径包括直接和间接传 播，主要通过性行为传播3。以往诊断方法常采用生理盐

8、水涂片法，此法虽简单 、快速，但在感染度轻、气温较低、虫体不活动或死亡时，常易漏诊。涂片染色和培养法， 由于操作麻烦，费时，而临床一般不采用。免疫学诊断方法已有许多报道46 ，但都费时，费材料，有些还需要特殊仪器，限制了临床应用。硝酸纤维素膜作为载体进行斑点酶联试验，定量加抗原，受载体批间差异及其抗原吸附性能 等因素影响较少，不仅广泛用于各种核酸、蛋白质的转移电泳中，而且也可作酶联免疫反应 用的高效固相载体，国内外大多数报道是将抗原膜剪下置入反应板中进行反应。本法直接 将抗原膜浸入分泌物中反应，大大简化了操作步骤，节省了试剂材料。108例生理盐水涂片法检查为滴虫阳性者其抗体阳性率为92.5%。

9、108例生理盐水涂片法滴虫 阴性中，抗原阳性率为14.8%，55例真菌阳性者分泌物抗原滴虫抗体阳性率为0。实验结果还 显示，斑点酶联法具有较高灵敏性，重复性也很好。斑点酶联免疫吸附试验还具有操作简单 ，不受温度影响，而且由于硝酸纤维素膜对抗原蛋白有较好吸附浓集作用，所以尽管本试验 中抗原量使用甚微，但圆点中央的单位面积抗原浓度远远高于聚苯乙烯反板孔中的表面抗原 浓度。所以，斑点酶联法的敏感性也就大大高于常规酶联法了。本试验中使用的底物是AEC ，对人体无毒，可解除操作人员的后顾之忧；反应快，仅数分钟；颜色艳丽，结果观察不需 任何特殊仪器；结果不褪色，能够客观、永久地保留。我们实验显示，斑点酶联

10、免疫吸附试 验在诊断滴虫性阴道炎的应用中，具有良好效果，尤其适合于寒冷地区，条件较差、资金匮 乏的基层医疗单位推广应用。赵文翠(青岛大学医学院附属医院， 山东 青岛 266003)赵淑萍(青岛大学医学院附属医院， 山东 青岛 266003)宫玉香(青岛大学医学 院寄生虫教研室 山东 青岛 266003)参考文献：1刘约翰，赵慰先. 寄生虫病临床免疫学M. 重庆： 重庆出 版社，1993. 333-335.2郭春祥. 介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记，抗袋子本 的过碘酸钠法J. 上海免疫学杂志，1989，3(2)：97.3Mathews HM. Evaluation of two s

11、erological tests for Tri chomonas vaginalis infectionJ. J Clin Microbiol, 1983, 17: 840.4Watt RM. A rapid assay for the immunological detection of Trichomonas vaginalisM. Abstracts of the Annual Meeting of the Am erican Society for Microbiology, 1986. 86: 424.5Tsing S. Development of a monoclonal antibody based direct immu nofluorescent slide assay for Trichomonas vagin