淋巴细胞分层液提高上皮细胞培养效率

1、    淋巴细胞分层液提高上皮细胞培养效率        作者单位：香港中文大学威尔斯亲王医院矫形外科及创伤学系【摘要】目的尝试应用淋巴细胞分离液收集纯度高、活性强的上皮细胞进行体外培养，探讨是否可以加快上皮细胞培养的速度。方法根据上皮细胞和成纤维细胞比重上的差异，将经过胰酶处理后的小白鼠皮肤，用镊子把上皮和真皮层撕开，收集两层之间的基底细胞，并把这些细胞悬液加入淋巴细胞分层液(LP)中，收集中间层的细胞作为实验组进行体外培养，以传统方法分离的细胞培养作为对照组 。两组同时进

2、行对细胞生长速度的三种测试：上皮细胞生长曲线测定、Lowry蛋白测定和H+3胸腺嘧啶核甙测定。结果经统计学分析证明，实验组的细胞生长速度与对照组比较有明显加快的表现。结论淋巴细胞分层液能获得活力强、生长快的细胞，可缩短培养成上皮细胞皮片的时间，有一定的临床意义。【关键词】淋巴细胞分层液上皮细胞Improving the rate of skin keratinocyte cultureapplication of a lymphocyte isolation fluid Wu HT,Hung LK,Leung PC,et al.The Department of Orthopaedics &a

3、mp; Traumatology,Prince of Wales Hospital,Chinese University of Hong Kong【Abstract】Objective This study was to improve the rate of skin keratinocyte culture by application of a lymphocyte isolation fluid.Methods A lymphocyte isolation fluid“Lymphoprep”contains 5.6%(W/V) of Ficoll,with a density of 1

4、.077g/ml.According to the difference between the densities of keratinocytes(1.065-1.085g/ml) and fibroblasts(1.025-1.050g/ml),the two cell types can be separated by suspension in the solution.We performed a controlled study in new born mice:the epidermis and dermis of skin were separated by forceps

5、after trypsinization.The cell suspension collected was laid over Lymphoprep after centrifugation at 23,8000 g for 10 min.The keratinocytes were collected at the middle-interphase,and these cells were pure and viable keratinocyte cells.Results In subsequent keratinocyte culture we found that the cell

6、 growth was faster than cells obtained from conventional technique.It greatly shortened the preparation time of keratinocyte cell sheet.Conclusion The method will be valuable clinically for treatment of burn patients.【Key words】 Lymphoprep Isolation fluid Epithelium Cell自体植皮是烧伤病人和皮肤溃疡病人的主要治疗方法之一。近年来

7、已有不少报道应用自体皮肤分离出上皮细胞进行体外培养，制成上皮细胞皮片覆盖于伤口上，以促进上皮的生长和伤口的愈合14。但体外培养的时间一般都较长(1623天)，不能及时应用，因此我们尝试使用Lymphoprep(LP)淋巴细胞分层液(厂家：Nyegarrd Co,Norway)利用成纤维细胞与上皮细胞比重的不同，经离心后获得纯度高、增殖快的上皮细胞，加快了制成上皮细胞皮片的速度5。一般情况下，应用LP分离法，每平方厘米的皮肤可收集得到1×106的活上皮细胞，经接种在无3T3纤维细胞饲养层的75cm+2培养瓶培养1012天后，即可获得大约4cm×5cm的上皮细胞皮片。而应用传统

8、的分离细胞方法及使用3T3纤维细胞作饲养层需较长时间(预备3T3饲养细胞层需35天，培养上皮细胞需要1318天)。1材料和方法以初生小白鼠为实验动物，分实验组与对照组，实验组应用LP加强分离上皮细胞，而对照组则不使用LP。两组的细胞培养均不使用3T3作为饲养细胞层4。无菌操作下取初生小鼠皮肤，去除脂肪，切成1mm×10mm小块皮片，放入0.125%胰酶中置4消化过夜。次日取出放入37温箱30分钟，然后用小牛血清中止胰酶反应。把消化后的皮片放入盛有DMEM营养液的培养皿上，用小镊子把上皮和真皮撕开，两层之间的基底细胞落入DMEM营养液中。同时用毛细吸管小心吹打上皮底层及真皮上层的细胞，

9、用铜筛过滤后，收集这些细胞悬液，用计算盘数细胞总数和死、活细胞数(用台盼蓝作染色，蓝色的细胞为死细胞，不着色者为活细胞)，作记录。把同一批的细胞悬液分成两等份，分别给对照组和实验组使用。对照组直接把这些细胞悬液用上皮细胞培养液(KGM培养液)稀释成0.5×106细胞/ml，接种于24孔的培养板上，置37温箱培养，而实验组则先用毛细吸管把细胞悬液轻轻置于等量的LP之上，经2000r/min离心10分钟后，小心吸取中间的细胞层，用DMEM营养液洗一次，然后数细胞总数及死、活细胞数，并用KMG培养液稀释成0.5×106细胞/ml接种于24孔培养板上，置37温箱培养。在细胞培养过程

10、中，实验组和对照组同时作以下三种对细胞生长速度的测试。1.1上皮细胞生长曲线测定对照组和实验组接种的细胞数相同(0.5×106细胞/孔)、培养液相同，每周换液3次。分别在实验当日、及实验后第1，2，4，7，9，11，13，15，17，20，22日抽检一组，先吸出培养液，加胰酶消化数分钟。吸出消化液再把原培养液倒回，用吸管吹打培养孔底部细胞制成悬液，计算出每毫升细胞数，及死活细胞比例，绘制曲线。1.2Lowry蛋白测定测试日期与测试细胞生长曲线相同，先配制不同浓度的BSA标准溶液制作标准曲线。弃去培养孔内营养液，用0.15mol/L NaCl洗3次。然后加入0.25mol/L NaOH

11、置室温30分钟，移入试管内，再加等量0.25mol/L HCl中和。加入Lowry试剂摇匀后置室温20分钟。加入酚红试剂摇匀，置室温30分钟，用紫外线光谱仪在750nm光段测读数，绘制曲线。1.3H+3-胸腺嘧啶核甙测定利用同位素H+3标记胸腺嘧啶核甙的测定，可作为DNA合成物的检测量度上皮细胞增殖的活力6。测试日期与生长曲线测定及蛋白测定相同。配制并加入H+3标记胸腺嘧啶核甙DMEM培养液于培养孔内，置37含5%CO-2的温箱内4小时，弃去培养孔内液体并用0.15mol/L NaCl洗1次。加入0.25mol/L NaOH置温室20分钟以溶解细胞，并移入试管内。用等量的0.25mol/L H

12、Cl中和反应，加入含有BSA的Hepes-Mg-Ca试剂和10N PCA，放置-20冰箱过夜，次日放420分钟。用12000r/min低温离心沉淀30分钟，弃去上清液，用0.25mol/L NaOH溶解沉淀物。移入测试管内，加入闪烁液并在闪烁测量仪内测试读数。所得数据均按双因素方差分析法，t检验等方法进行统计学处理。2结果2.1同一实验重复4次。实验组用LP分离法每平方厘米皮肤所得细胞总数为98×104，其中活细胞数92.86×104。而对照组分离所得细胞总数为397×104，其中活细胞数328×104。虽然实验组分离所得的细胞总数少于对照组，但活细胞比

13、率却明显高于对照组，t检验：实验组(94.7171±1.4610)对照组(82.6097±2.4937)差异有非常显著意义(P<0.001)。2.2以相同的活细胞浓度(50×104细胞/孔)接种培养24小时后，实验组已有44.7×104的细胞贴壁生长，而对照组只有21×104细胞贴壁。t检验活细胞比率分别为89.4592±2.9550与42.5292±3.8170，差异有非常显著意义(P<0.001)。2.3在细胞培养的第4天，实验组的细胞已长满培养孔底部(1)，而对照组的细胞只长成细胞集落(2)，直至在第13天

14、才长满培养孔底部。2.4上皮细胞生长曲线(3)和Lowry蛋白测定(4)均显示实验组在细胞接种24小时后便迅速增殖，直至第9天开始减慢。而对照组在接种7天后才开始迅速增殖，第15天速度减慢，组间比较，从接种后第113天实验组各时相点显著高于对照组(P<0.001)。H+3-胸腺嘧啶核甙测定(5)显示实验组和对照组在接种后细胞增殖的活力不断上升，第7天到最高峰，7天后开始减弱，组间比较，实验组各时相点亦显著高于对照组(P<0.001)。+2=161.4545， P<0.00013上皮细胞生长曲线Fig 3 Epidermal cell growth curue+2=138.48

15、03，P<0.00014Lowry蛋白测定Fig 4 Lowry protein assay+2=131.5786，P<0.00015H3-胸腺嘧啶核甙测定Fig 5 H+3-Thymidine assay3讨论实验证明用LP能分离出高纯度高活力的上皮细胞。这些细胞在培养后第4天便长满培养孔底部。而对照组接种的细胞由于混有其他细胞成份，例如组织碎片，无增殖能力的角化上皮细胞、少量的纤维细胞等。这些细胞的代谢产物及所占据的空间，影响了有增殖能力的上皮细胞的贴壁和繁殖，以至在接种后最初几天新增殖的细胞数目和死亡的细胞数目几乎相等。H+3-标记胸腺嘧啶核甙测定显示上皮细胞增殖活力最强是在

16、细胞培养的初期，第7天达最高峰，7天后开始减弱。实验组由于在第4天已经长满一层细胞，到细胞活力最高的第7天已经长成超过一层的细胞层。而对照组由于在第7天才开始有机会迅速繁殖，其活力已开始减弱，所以在第13天才长满一层。实验结果证明用LP分离上皮细胞进行细胞培养，大大缩短了制成上皮细胞皮片的时间，在临床应用上具有一定意义。但是由于用LP分离上皮细胞过程中会失去较多量的细胞，因此在技术上有待进一步改进。(本文1，2见插页第6页)淋巴细胞分层液提高上皮细胞培养效率1实验组：皮肤上皮细胞培养第4天，上皮细胞之间互相融合成片2对照组：皮肤上皮细胞培养第4天可见上皮细胞集落并有上皮细胞横跨细胞集落之间Fi

17、g1 Skin keratinocyte culture at day 4 after plating in test group, The picture shows that the epithelial cells were confluenct Fig2 Skin keratinocyte culture at day 4 after plating in control group,The picture shows that there are only some epithelial cell colonies and some cell processes across col

18、ony参考文献1Liu S，Karasek M.Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.J Invest Dermatol,1978,71:157-162.2Karasek M,Charltom M.Growth of postembryonic skin epithelial cells on collagen gels.J Invest Dermatol,1971,56:205-210.3Freeman A,Igel H,Herrman B,et al.Growth and characterization of human skin epithelial cell cultures.In Vitro,1976,12:352-362.4