第二十二章 淋巴细胞转化试验技术

1、第二十二章 淋巴细胞转化试验技术(Lymphocyte transformation test technique)一、基本原理当机体受到抗原（包括特异性的如结核菌素或非特异性的如植物学凝素，PHA等）的刺激时，T淋巴细胞就可以转化为淋巴母细胞，进一步转化为致敏淋巴细胞。这种转化在一定的程度上代表着机体的细胞免疫功能状态。这种转化也可在体外的T细胞的培养过程中加入适当的刺激原而出现，并表现出形态上的变化。目前常采用PHA诱发的淋巴细胞转化试验作为检查机体细胞免疫的功能状态。具体方法主要有两种：一是形态学检查法，即在加有PHA的培养基中，培养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算淋巴细

2、胞的转化率；另一种是同位素标记物掺入转化法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，此时若将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，则被DNA的原料摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客观地测定淋巴细胞的转化程度。后者方法更为准确，且重复性好。二、形态学检查法（一）材料与试剂1小牛血清 取新生的小牛，无菌采血，分离血清。于56灭活后分装小瓶，放入低温冰箱保存。2双抗 配成每毫升含青霉素1.00×104U，链霉素1.00×104U的混合液。存放于-20。36%NaHCO3水溶液4肝素 以灭菌生理盐水配成5

3、00U/ml，115灭菌30min，4保存备用。5PHA 以灭菌生理盐水配成1 000µg/ml，经G-5漏斗过滤，分装小瓶，保存于-20备用。6姬姆萨染液、瑞氏染液。7pH6.4磷酸盐缓冲液：KH2PO4 6.62gNa2HPO4 2.56gH2O 1 000.00ml8营养液 采用199营养液或RPMI1640营养液，配法如下： 199营养液 79.00ml 小牛血清 20.00ml “双抗” 1.00ml依次加入后，再用高压灭菌的6% NaHCO3液调pH至7.27.3，分装小瓶，每瓶0.2ml。（二）操作方法1 于培养瓶内加0.2ml马血，对照组与试验组各做2瓶，试验组均加P

4、HA30µg；237培养72h，每天轻摇12次；3取出培养瓶，摇散血块，倒入离心管，3 000r/min离心10min，去上清液；4用血球泥制备推片，晾干；5以瑞氏染液染2min3min，加等量缓冲液，混匀继续染3min，蒸馏水冲洗后再用姬姆萨染液染2min3min。加等量缓冲染液感作7min8min，馏水冲洗，晾干；6镜检，观察，计数。（三）结果判定 在油镜下，观察淋巴细胞的形态变化（见表21-1），以头、体、尾三部分计算，至少计数100个或200个淋巴细胞，然后按公式计算出淋巴细胞形态转化率。成年马的淋巴细胞转化率，根据原兽医大学20例检查，平均为35.58%。不加PHA的对照组

5、一般不转化或转化率只在1%左右。表21-1 淋巴细胞转化前后形态学特点项 目未转化型转化型过渡型大 小（µm）核与胞浆比例核 位 置核 仁染 色 体核周围透明区胞浆内空泡胞浆呈碱性710大几乎占全部胞浆少或无致 密不明显不明显不明显2035小中央或稍偏一个或数个疏松有分裂相明 显明 显明 显1216稍大偏一侧有或无疏松有有或无有转化淋巴细胞的形态特征：体积增大，约大于原成熟的淋巴细胞的23倍；细胞核膜清晰,核内染色质疏松呈网状结构，可见13个核仁,有的核呈分裂相；胞浆丰富，有嗜碱性染色，核周围的胞浆有一些淡染的透明带，细胞呈伪足状突起。（四）注意事项1培养液最适pH为7.27.4，过

6、酸过碱都会影响细胞的生长而降低转化率。培养液的类型与动物的白细胞有关，如小鼠的淋转试验，用RPMI-1640最好，用199液则不成功。2培养时间 以72h120h转化率最高，超过这个时间，则转化率反而下降。3吞噬细胞有时在形态上易与“过渡型”混淆。但巨噬细胞有其固有的特点，核占细胞比较小且偏一边，核染色质浓集，细胞浆呈蓝灰色或红褐色，胞浆内有大小不等的颗粒或吞噬物，且含有大小不等的气泡。4涂片要少蘸些细胞，推出尾部来，因淋巴细胞较大，易集中在尾部及边缘。5观察淋巴细胞转化，染色不要太浓，以便观察核仁。6严格的无菌操作，是淋巴细胞转化试验成功的关键。三、H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法（一

7、）材料及试剂1培养基 RPMI-1640或TC199培养液2PHA 同形态学方法3小牛血清43H-TdR 选用比活性为2Mci10Mci/mg分子的制品，将1 Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100µci/ml，于4保存备用。临用时再用培养液稀释成10µci/ml溶液。53%冰醋酸6浓甲醛730%H2O2液8闪烁液PPO（2，5二苯基噁唑） 5.00gPOPOP1,4-双(5-苯基噁唑基-2苯) 0.30g无水乙醇 200.00ml甲苯 800.00ml混合即可（二）操作方法1培养液中按1%的体积加双抗（含青霉素1万U/ml，链霉素0.01g/ml）及肝素液（含肝素100U

8、/ml）。用3.5%NaHCO3液调pH值为7.27.4，然后加灭活的小牛血清，使浓度为20%。再加PHA（50U75U/ml），无菌分装于培养瓶内，每瓶1ml。2无菌操作采血，并以肝素抗凝，同时进行白细胞计数及分类计数。3取0.1ml抗凝血，加入到含1ml培养液的培养瓶中，每个血样接23个培养瓶。如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血，加入培养瓶中更好。437培养72h，在培养结束前16h24h，每瓶加入3H-TdR 1µci。5培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml，分两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也装入离心瓶中，2 000r/min离心10min，去上清。沉淀再用3%冰醋

9、酸洗涤一次，同样离心去上清。6在沉淀中加30%H2O2液一滴，85水浴15min，待溶液呈无色时，再加甲酸0.5ml，继续加热（85）30min，使沉淀物完全消化溶解。7将消化溶解的液体移入测样杯内，用红外灯或80热空气烘烤至液体体积少于0.1ml，加闪烁液5ml，用液体闪烁液计数器测其脉冲数。8第57步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备。即：培养结束后，将培养液移入离心管，2 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤一次、再离心。将沉淀移至滤膜上（注意将沉淀全部移入），减压抽滤，并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸（若有带色物质，用30%H2O2液脱色）和3ml

10、无水乙醇抽滤。取出滤膜，6080烘干，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中（贴细胞的面朝上），用液体闪烁液计数器检测。（三）结果判定 以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值，即为0.1ml血样的脉冲数。全血检测的脉冲数，再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。也可以刺激指数（SI）表示试验结果。为此须在培养时，设同样数量的不加PHA的对照培养瓶，试验管脉冲数与对照管脉冲数之比，即为刺激指数。（四）注意事项1血样与培养基比例一般在1:101:30为宜。2培养细胞时，可放入CO2培养箱中培养，也可在普通温箱进行培养，但一定要把盖子拧紧，否则结果差别较大。3以SI表示结果时，一定要设置相同数量培养管的对照（即不加PHA）。而以cpm绝对值表示（cpm/106淋巴细胞）则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。4闪烁液的容水量很低，所