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文档简介

1、实验二十 感受态细胞的制备及外源基因导入原理 转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R-、M-符号表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2、MgCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗

2、传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant）即带有异源DNA分子的受体细胞。 本实验以E.coliDH5菌株为受体细胞，用MgCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC19质粒共保温，实现转化。pUC19具抗氨苄青霉素的特性即Ampr，将转化后的全部受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。试剂1. 1、E.coli DH5受体菌：R-、M-、Amps2. pUC19质粒3. 5×LB培养基4. 100g/ml氨苄青霉素5. 含氨苄青霉素的LB平板

3、培养基6. TSS 将10%PEG8 000、5%DMSO、20mmol/L MgSO4，各成分溶于100ml LB培养液中，过滤除菌。7. 含20mmol/L葡萄糖的1×LB器材1. 恒温摇床2. 电热恒温培养箱3. 无菌操作超净台4. 电热恒温水浴箱5. 紫外分光光度计6. 离心机7. 塑料离心管8. 移液器操作步骤1.大肠杆菌感受态细胞的制备（1）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35mlLB液体培养基中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。（2）取50l该菌悬液接种于5ml LB液体培养基中，37振荡12h， 当培养液开始出现混浊，停止培养。（3）将1ml细菌加入1个1.5ml塑料离心管中，12 000rpm离心2min沉淀细菌，弃去上清。（4）将细胞重悬于100l TSS缓冲液中。2.细胞转化（1）在上述细胞悬液中，加入pUC19质粒DNA（含量不超过50ng）。此管为转化实验组。其他管按下表进行N0.质粒DNA/l（pUC19）感受态细胞/l无菌水/l1×TSS/l样品2100对照11002对照22100（2）将各样品轻轻摇匀，冰上放置10min。（3）加0.9ml含20mmol/L葡萄糖的TSS溶液，于37振荡培养1h。5000r/min离心5min，弃去900l，将沉淀混匀。（4）将细胞悬液铺布于含100g/ml氨苄

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