实验性变态性脑膜炎

1、实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental allergical encephalomyelitis,EAE中山医科大学神经病学教研室 胡学强 饶从志目 录一 . 简介 -二 . 前言 -三 . 方法介绍 -(一 动物的选择 -(二 致脑炎抗原的种类 , 选择和制备 -(三 致敏途径和不同 EAE 的诱导方法 -(四 评价 -1.临床评价 -2.病理评价 -3.生化 , 免疫方面评价 -4.影像学 , 电生理评价 -(五 EAE 的防治 -四 .EAE 的应用价值 -五 . 参考文献 -实验性变态反应性脑脊髓炎一 . 简介实验性变态反应性脑脊髓炎 (Experimental aller

2、gical encephalomyelitis,EAE是实验动物发生的 一种变态反应性疾病。由神经组织 (或病毒 诱导产生的局限在神经系统内反应的迟发型超敏反应型自身 免疫病。根据致敏的方式和动物不同的遗传背景,可诱导出不同病程的临床和病理过程的 EAE , 并用于作 为研究人类中枢神经系统脱髓鞘疾病的动物模型。本文将介绍 EAE 的建立及评价方法。二 . 前言实验性变态反应性脑脊髓炎 (Experimental allergical encephalomyelitis,EAE是实验动物发生的 一种变态反应性疾病。由神经组织 (或病毒 诱导产生的,由淋巴细胞介导的,以中枢神经系统内血管周 围单

3、核细胞浸润和白质脱髓鞘为特征的变态反应性疾病。根据致敏方法的不同,可诱导敏感动物产生超急 性、急性和慢性过程的 EAE ,并长期作为人类中枢神经系统脱髓鞘疾病的动物模型, 为探讨其病因、发病 机制以及药物试验性治疗疗效观察提供研究材料和对象。三 . 方法介绍(一 动物的选择不同种属动物对 EAE 敏感性不同, 因而 EAE 的建立与选择的动物种属关系很大。 经免疫遗传研究发现 EAE 的发生受遗传因素制约, EAE 的易感性受免疫反应基因 ( Ir基因 影响,它直接控制实验动物对抗原刺激的 免疫反应 1。 Ir 基因调节作用主要表现在:T 细胞参与作用, T 细胞表面呈现 Ir 基因对 MBP

4、 特异性表达, 在 识别相同的 MHC 类抗原下,对致敏脑炎抗原产生特异性免疫反应,因此 T 细胞表面有对 MBP 特异性 Ir 基因表达的受体能控制和决定 EAE 易感性。此受体能与 MBP 的特异性致脑炎抗原决定簇结合,而使脑炎发生 2。 研究证实对 EAE 高度抵抗的实验动物 T 细胞上缺乏对 MBP 反应的受体,所以不能发生 EAE 。长期实验动物研究认为最适合作为研究对象的实验动物是鼠、兔、猴,但由于它们种类不同对 EAE 敏 感性也就不同。鼠:Lewis 鼠对 EAE 非常敏感; SJL/J、 SWR/J鼠对 EAE 也很敏感; 中国的 KM 鼠对 EAE 也敏感; 而 Bow-N

5、orway 鼠、 Balb/c鼠对 EAE 有高度抵抗性,证实 B-N 鼠和 Balb/c鼠 T 细胞上缺乏对 MBP 反应的受体 1,3。兔:日本大耳白兔和新西兰白兔对 EAE 敏感。证实兔类 Ir 基因位于 17 号染色体短臂上 4。猴:恒河猴和食蟹猴对 EAE 敏感,证实决定其易感 EAE 的因子之一是 MHC-DPB1等位基因 5,6,7。 建立不同种属动物的 EAE ,应选择条件为:612周龄、不同窝别、雌雄均有的敏感鼠; 510月龄、 2.03.0kg(体重 、不同窝别的、雌雄均有的敏感兔; 34岁、 34kg(体重 、不同窝别的、雌雄均有 的敏感猴。(二 致脑炎抗原的种类、选择和

6、制备EAE的致脑炎抗原具有器官特异性,而没有种属特异性, 存在所有温血动物中枢神经系统的白质内 8。从始至今使用的致脑炎抗原的种类有:同种型、 异种型或同种异型温血动物的全脑、脊髓组织或其 中的白质 (Rivers, 1933年 ,髓素蛋白脂蛋白 (Hitherto,1958年 ,髓素碱性蛋白 (Kiers,1965年 , 用消 化酶分解后的肽片 (Dale,1974年 , 蛋白脂阿朴蛋白 (Rosemarie,1982年 , 大脑内皮细胞膜 ( Rose,1987年 以及 MBP-特异性 T 淋巴细胞。另外,还有人用过病毒如单纯疱疹型病毒 (Hocherg,1977年 。用以上这些 抗原可以

7、诱导出超急性、急性、慢性 EAE 。现今选择使用较多的致脑炎抗原是温血动物全脑或脊髓组织中的白质、提取的纯化 MBP 以及分解后 MBP 肽片段和人工合成的 MBP 肽片段。另外, 还有蛋白脂阿朴蛋白。其制备方法见下图:温血运动脑或脊髓组织中的白质(新鲜冻存于 -70以下 (W/V=1/1加 PBS(PH7.2在低温下用匀浆机制成白质匀浆 酸化脱脂 取适量匀浆加 CFA(含 BCG2mg/ml (V/V=1/1MBP 人工合成的 MBP 肽片段水油乳化剂即可作致敏用蛋白脂阿朴蛋白加 CFA(含 BCG2mg/ml按 V/V=1/1图 : 致脑炎抗原制备过程不同实验敏感动物所需的致脑炎抗原的量不

8、同。其所需量大致如下:表 1. 不同实验敏感动物所需的致脑炎抗原量-动物 CNS中的白质 水油乳化剂 MBP-鼠 1mg 0.10.2ml 12ug兔 50mg 0.20.25ml 100200ug猴 200mg 0.50.6ml 400600ug-(三 致敏途径和不同 EAE 的诱导方法致脑炎抗原的兔疫途径有多种:皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉注射。经大量实验研究证实皮下多部 位注射致脑炎抗原诱发 EAE 的发生率最高, 因而常用的注射途径是皮下注射 9。EAE的产生不仅与实验动物和致脑炎抗原有关外, 而且与致敏方法密切相关。由于致敏方法的不同, 可诱导产生超急性、急性和慢性病程的 EAE 。

9、 具体实施方案如下:若给实验动物一次注射大剂量致敏原和CFA ,同时注射百日咳菌苗, 动物免疫后 78天发病,这就是超急性 EAE ; 若给实验动物一次注射较大剂 量的致敏原和 CFA ,动物在注射后 2周左右发病,这就是急性 EAE ; 若给实验动物间隔一周注射较小剂量的 致敏原和 CFA ,急性起病后有缓解复发的病程,或急性 EAE 经不当治疗也可有缓解复发,这些均是慢性复发 性 EAE(Cr-EAE10。(四 EAE 的评价1.临床评价超急性 EAE 动物起病非常迅速,死亡率高,大部分动物立即瘫痪, 迅速进入昏迷,最后死亡。急性 EAE 急性起病 , 呈单相病程。表现为突然出现肢体乏力,

10、尤其是后肢,继之瘫痪,共济失调步态, 震颤,括约肌失禁,约三分之一或二分之一患病动物进入昏迷,最后死亡,其余动物呈现不同程度恢复。 慢性 EAE 起病较慢,呈缓解复发病程,表现为视力下降,体重下降,肢体乏力,厌食,共济失调步态 等。具体临床评分见下表 7:表 2. 临床评分表-临床表现 得分-无神经系统症状、体征 0嗜睡、厌食、体重下降 1共济失调、震颤、抽搐 2盲、截瘫、偏瘫 3四肢麻痹,四肢瘫 4死亡 5-2.病理评价 8超急性 EAE 脑和脊髓白质内广泛血管壁坏死和灶性出血,纤维素沉着, 血管周围炎性细胞浸润,主要 是多核细胞。急性 EAE 髓鞘崩解脱失,脑脊髓内小血管周围炎性细胞浸润,

11、 即“血管套”形成,小血管壁炎性细胞 浸润,血管壁炎性增生,病灶播散在整个中枢神经系统白质内,常靠近脑室系统附近。另外,注射局部有 炎症反应,甚至有溃疡形成,局部淋巴结肿大。慢性复发性 EAE 中枢神经系统白质内血管周围有细胞浸润,伴有脱髓鞘 -髓鞘再生斑,以及胶质疤痕形 成。3.生化 , 免疫方面评价 5,6,7超急性 EAE 特异性抗 MBP IgE抗体升高,生物活性物质升高等,符合速发型变态反应。急性 EAE Th升高, Ts 下降, TNF 升高, INF 下降, IL-2、 6、 10、 12升高, Sz1-2R升高, CNS 鞘内 IgG 合 成量升高,合成率升高, IgG 组分区

12、带阳性, MBP 及其抗体升高,符合迟发型变态反应。慢性复发性 EAE 其免疫、生化改变同急性 EAE 。4.影像学、电生理评价 11,12电子计算机 X 线断层扫描 (CT可发现脑部早期病变,主要是散在、多发、 大小不一的白质低密度灶, 主要是散在、多发、大小不一的白质低密度灶,较对称地散布在脑室周围,大脑中央部白质、脑干和小脑 脚。急性期和复发加重期,病灶可增多,部分可强化。稳定期病灶可缩小。核磁共振影像 (MRI是更有价值的检查方法,对 EAE 的评价有很高的价值 11。病灶主要表现多为散在 分布和融合两种。病灶可累及脑室旁、胼胝体、大脑半球白质、脑干、小脑和脊髓等。病灶的信号强度随 疾

13、病的不同阶段及使用的扫描参数而变化,在急性期和进展期, T1加权像多表现为等信号或略低信号, T2加权则多表现为高信号。在慢性稳定期, T1加权呈均匀的低信号,边界清楚, T2加权像呈均匀高信号。 电生理检查以脑诱发电位价值较大,能检测出中枢神经系统内病变,有时甚至是临床下隐匿性病灶, 为临床评价提供客观依据 12。临床上常进行视、听觉及体感诱发电位检查。其主要表现为潜伏期延长、 波形异常、波幅降低甚至平坦。 (五 EAE 的防治EAE的药物试验有多种方法能防止 EAE 的发生。例如 (1 据报道采用一次大剂量注射同种型神经组织给 新生鼠可导致无免疫反应, 多数新生鼠不发生 EAE ; (2采

14、用皮下或脑内注射纯化致脑炎抗原后再免疫动物, 亦可抑制 EAE 的发生; (3预先单纯注射佐剂 CFA 后,再免疫动物,亦可防止 EAE 的发生; (4 在注射后尽早 摘除注射局部淋巴结或行局部放疗,也将防止 EAE 的发生。EAE同其它自身免疫病一样,可用免疫抑制剂如皮质类固醇、 硫唑嘌呤和环磷酰胺等药物治疗。 目前正在试行以下方法抑制和预防 EAE 的发生:(1有 MBP(鞘内注射、口服 ,共聚物 -,脾细胞结 合 MBP 多肽, MHC 结合多肽,脂质体结合人 MBP 多肽等可阻滞抗原识别,从而阻止或抑制 EAE 发生; (2用嵌合型 CD4单抗、抗 TCR 单抗、抗粘附分子单抗、抗 M

15、HC 单抗等作用于激活的 T 细胞诱导的免疫反应,从而 抑制 EAE 的发生; (3接种 T 细胞、 TCR 多肽能抑制、预防 EAE 发生; (4用 PAF 拮抗剂 (银杏内酯 保护血脑屏 障,从而抑制 EAE 。国外,现已试用上述的一些方法治疗人类多发性硬化 ( MS患者,但结果尚未肯定,有 些方法尚有待摸索、改进 13四 .EAE 的应用价值长期以来研究认为 EAE 与人类中枢神经系统脱髓鞘疾病无论在临床表现、病理、以及免疫发病机制等 方面都极为相似, 因而作为研究人类脱髓鞘疾病的动物模型 14,15。早已公认超急性 EAE 、急性 EAE 是人 类急性出血性坏死性脑炎 (AHLE、 急

16、性播散性脑脊髓炎 (ADEM的动物模型,但不能完全代表人类 AHLE 和 ADEM, 在发病机制方面, AHLE 和 ADEM 还有一些问题尚未解决。EAE和 MS 的关系是当今研究的热点问题。采用 EAE 研究人类 MS 的发病机制已进行了几十年,但其病因和 发病机制至今未明。研究中不断发现急性 EAE 和 MS 有些方面虽然相似,但存在许多不同之处,而慢性复发 性 EAE(Cr-EAE更接近 MS ,是研究 MS的最佳模型。早在 1933年 Rivers 在猴建立 Cr-EAE 以来,许多学者如 Raine(1984年 、 Cohen(1986年 和 Mackey(1973年 等采用各种方

17、法建立了不同种属动物的 Cr-EAE ,并将 Cr-EAE 与 MS 进行了详细比较,认为 Cr-EAE 在临床上有缓解、复发病程, CNS 内存在原发性脱髓鞘斑和班块 融合现象、胶质增生反应等;免疫改变有 Th 升高, Ts 下降, IL-2、 6、 10、 12, Sz1-2R 升高, IgG 组分区带, IgG 合成率升高, MBP 及其抗体升高等,这些改变与 MS 极其相似,是研究 MS 的最佳模型,尤其是 Cr-EAE 更 是如此 10,16。但在致病因子、临床、病理、免疫反应等方面与 MS 还有一些不同之处,表现在如下方面: (1致 Cr-EAE 的致敏原明确,是由 MBP 中的脑

18、炎因子所致,但 MS 是何种抗原引起的疾病至今未明,大多 数学者认为 MS 是与病毒感染、遗传、自家免疫以及环境、内分泌等有关的多致病因素疾病。(2Cr-EAE的整个进程比 MS 更急性,更象急性 MS ,而多数 MS 的过程进展慢, 病程一般数年数十年。(3Cr-EAE脊髓病变区常位于脊髓表面,而 MS 病变区主要位于白质深层。(4细胞免疫反应证实, EAE 系细胞介导的迟发性变态反应,以细胞免疫介导为主,而 MS 尚未获得充分 证据证明是迟发性超敏反应。(5慢性 EAE 有不同的动物模型,比较发现猴 Cr-EAE 较鼠、兔 Cr-EAE 更近于 MS 。综上所述,研究急性和慢性 EAE ,

19、揭示了 CNS 炎性脱髓鞘疾病的病理现象,详细了解 CNS 内细胞和体液 免疫机制在发病机制中的重要作用。 这些结果将为研究人类脱髓鞘疾病提供了重要资料。虽然慢性 EAE 不 能完全代替 MS ,但对于研究 MS 的病理过程、发病机制以及观察各种治疗效果都十分有价值。五 . 参考文献1.Vincert KT, et al. Myelin proteolipid protein- induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mic

20、e. J Immunol 1988;140:18682. 袁锦楣主编 . 临床神经免疫学 . 第一版,北京:北京科学技术出版社, 1988; 1233.Lando Z, et al. Induction of experimental allergic encephalomyelitis in genetically resistant strains of mice. Nature 1980;287(5182:5514.Vincert KT, et al. A synthetic peptide from myelin proteolipid protein induces experime

21、ntal allergic encephalomyelitis. J Immunol 1988;141:11265.Rose LM, et al. In viro administration of anti- CD4 monoclonal antibody prolongs survival in longtails macagues with experimental allergic encephalomyelitis. Clin Immunol Immunopathol 1987;45:4056.Rose LM, et al. Fluctuations of T- and B- cel

22、l subsets in basic protein induced EAE in tongtailed macagues. Clin Immunol Immunopathol 1987;44(1:937.Massacesi L, et al. Experimental allergic encephalomyelitis in Cynomolgus monkeys: Quantification of T cells in peripheral blood. J Clin Invest 1992;90:3998.Cedric SR, et al. Biology of disease. An

23、alysis of autoimmune Demyelination: It's impact upon multiple sclerosis. Lab Invest 1984; 50(6:6089.Robert S, et al. Induction of experimental allergic encephalomyelitis in suckling lewis rats: Role of age and type of sensitizing neuroantigen. J Immunol 1977;119(5:163410.Rose LM, et al. Experimental allergic encephalomyelitis in nonhuman primates: A model of multiple sclerosis. Lab Anim Sci 1994:44(5:50811.Pousset K, et al. experimental allergic encephalomyelitis and multipl