双向电泳所需试剂

1、GE Healthcare Life Sciences用户需要准备事项1. 确定电源接地2. 单蒸水3. 操作环境：1530 °C ±2 °C4. 操作环境湿度要求：相对湿度070%*5. 大量筒或烧杯 ( 1L, 500ml,250ml,50ml)6. 去离子水或MilliqQ水7. 提前购买染胶的盒子（30×20cm，最好有盖子）如需实验：准备样品和如下试剂。附录 I 溶液注意请按照实验所需量酌量或减量配制A. 双向电泳的样品裂解溶液(含有尿素) （8 M尿素，4% CHAPS，2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液(载体两性电解质)，40

2、mM DTT, 25 ml）最终浓度用量尿素(FW 60.06) 8 M 12 g CHAPS 4% (w/v) 1.0 g 两性载体Pharmalyte 或IPG缓冲液(现用现加) 2% (v/v) 500 µl DTT (FW 154.2) 40 mM 154 mg 双蒸水 至25 ml (需要水约16ml) 分装为 1.0 ml溶液储存于-20条件下。IPG buffer和DTT现用现加。酌情增减使用量,每个样品使用约1ml. (本次培训需要5ml)B. 尿素水化储备溶液 （8 M尿素，2% CHAPS，0.5/2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝

3、, 25 ml）*最终浓度用量尿素(FW 60.06) 8M12gCHAPS 2%(w/v)0.5g两性载体Pharmalyte或 IPG缓冲液(与IPG胶条的范围相同)(现用现加)0.5%(v/v) 125µl1%溴酚蓝储备溶液0.002%50µl双蒸水 至25ml(需要水约16ml)分装为1.0ml溶液储存于-20 条件下。每个样品使用约1ml. (本次培训需要5ml)使用前加入DTT和IPG buffer，每1.0ml水化储备溶液中加入2.8mgDTT。载体两性电解质或IPG缓冲液现用现加。 C. SDS平衡缓冲液(6 M尿素，75 mM Tris-HCl pH8.8

4、,29.3%甘油, 2%SDS,0.002%溴酚蓝,200ml)*最终浓度用量尿素(FW 60.06) 6 M 72.1 g Tris-HCl, pH 8.8 (参见溶液F部分) 75 mM 10.0 ml 甘油(87% w/w) 29.3% (v/v) 69 ml (84.2 g) SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 4.0 g 1%溴酚蓝储备溶液0.002% (w/v) 400 µl 双蒸水 至200 ml 这是储备溶液。在使用之前，按照一定量加入1%DTT（100mg/10ml）或2.5%碘乙酰胺（250mg/10ml），分别用于第一次和第二次平衡。Max用量 1

5、0ml/胶条。分装为20或50ml溶液储存于-20条件下。 （本次培训需要100ml） D. 10× Laemmli SDS电泳缓冲液(250 mM Tris碱，1.92M甘氨酸，1% SDS，10L)* 最终浓度用量 Tris碱(FW 121.1) 250 mM 303 g 甘氨酸(FW 75.07) 1.92 M 1441 g SDS (FW 288.38) 1% (w/v) 100 g 双蒸水 至10L * 不要调节该溶液的pH值。室温条件下储存。根据不同型号二向电泳槽，根据电泳槽规格每次实验用量1× Laemmli SDS电泳缓冲液 1-10L。 （本次培训配制1L

6、，用量分别为Tris 30.3g, 甘氨酸144.1g, SDS 10g,溶解在1L水里）E. 30% T, 2.6% C单体储液(30%丙烯酰胺，0.8% N, N-甲叉双丙烯酰胺，500ml)最终浓度用量丙烯酰胺(FW 71.08) 30% 150 g N,N-甲叉双丙烯酰胺(FW 154.17) 0.8% 4 g 双蒸水 至500mL用0.45m滤膜过滤溶液，4避光储存。F. 4×分离胶缓冲液(1.5M Tris碱，pH8.8，500mL)最终浓度用量 Tris碱(FW 121.1) 1.5 M 90.8g 双蒸水 375 ml HCl 调至pH8.8 双蒸水 至500mL 用

7、0.45m滤膜过滤溶液，4存储。G溴酚蓝储备溶液最终浓度用量 溴酚蓝1%100 mg Tris-碱50 mM 60 mg 双蒸水 至10 mL H. 10% SDS溶液(10% SDS, 50 ml)最终浓度用量 SDS (FW 288.38)10% (w/v)5.0 g双蒸水 至50 ml 用0.45m滤膜过滤溶液，室温存储。I. 10%过硫酸铵溶液 (10%过硫酸铵, 10 ml和1 ml) 最终浓度10 ml的用量 1 ml的用量 过硫酸铵(FW 228.20) 10% (w/v) 1.0 g 0.1 g 双蒸水 至10 ml 至1 ml 新鲜的过硫酸铵在加入水时发出“劈啪”声，若没有声

8、音，请更换过硫酸铵。在用前配制。J. 琼脂糖密封液(25mM Tris碱, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 0.5%琼脂糖, 0.002% 溴苯酚蓝, 10ml)最终浓度用量Laemmli电泳缓冲液（见溶液D）10 ml 琼脂糖(NA 或M)0.5% 0.05 g 1%溴酚蓝储备溶液 0.002% (w/v) 20 µl 将所有成分加入到100ml 的烧瓶中。轻轻地摇晃，使成分混匀。加热直至琼脂糖完全溶解。不要让溶液爆沸。以1.5ml为单位分装至带有螺旋帽的管内，室温保存。K. 水饱和正丁醇用量n, i, or t-butanol 50 ml50 mlDistilled or deionized water10ml Combine in a bottle and shake,use the top phase to overlay gels. Store at room temperature indefinitely.配12的分离胶，按下表加入各组分。一块胶需50ml胶液，两块胶需90ml胶液。12%SDSPAGE（单位：ml）510152025304050水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2468101216201.5 mol/L Tris (