南虎凝胶剂抗炎镇痛作用及其作用机制

1、南虎凝胶剂抗炎镇痛作用及其作用机制             作者：孔祥艳，肖长虹，吴启富，易世宏 【关键词】  南虎凝胶剂    Antiinflammatory and analgesic effects of Nanhu Gelata and its mechanism【Abstract】 AIM: To estimate the antiinflammatory and analgesic effects of Nanhu Gel

2、ata and to study its mechanism. METHODS:  Xyleneinduced mouse ear edema models and carrageenaninduced rat paw edema models were used to study the antiinflammatory effects. Hotplate test in mice was used to study the analgesic effects. The contents of IL1 and TNF in the carrageenaninduced rat pa

3、w edema tissues were measured using rat IL1 ELISA and TNF ELISA kits to explore the mechanism of its antiinflammatory and analgesic effects. RESULTS:  Nanhu Gelata significantly suppressed xyleneinduced mouse ear edema and carrageenaninduced rat paw edema. The pain threshold of hotplate test mi

4、ce was remarkably improved by Nanhu Gelata. The content of IL1 and TNF in the inflammatory tissue extracts significantly decreased. CONCLUSION:  Nanhu Gelata has some significant antiinflammatory effects on acute inflammatory reactions. Nanhu Gelata significantly relieves pain reactions induced

5、 by heat. The mechanism of antiinflammatory and analgesic effects of Nanhu Gelata may be related to its effect of decreasing the IL1 and TNF content in inflammatory tissues.【Keywords】 Nanhu Gelata; antiinflammatory effects; analgesic effects; mechanism【摘要】 目的：评价南虎凝胶剂的抗炎镇痛作用，揭示其抗炎镇痛作用机制. 方法：用二甲苯致小鼠耳肿

6、胀、角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型,考察南虎凝胶剂的抗炎作用； 热板法观察南虎凝胶剂的镇痛作用. 用大鼠IL1 ELISA试剂盒和大鼠TNF ELISA试剂盒检测角叉菜胶致炎大鼠足跖肿胀组织中IL1与TNF含量，了解南虎凝胶剂对炎性组织中IL1及TNF的影响，揭示其抗炎镇痛作用机制. 结果：南虎凝胶剂外用给药,可明显减轻小鼠耳肿胀度,降低角叉菜胶所致大鼠足爪肿胀，明显延长热刺激小鼠痛阈值，降低炎性组织提取液中IL1及TNF含量. 结论：南虎凝胶剂对炎症反应具有明显的抑制作用和中枢镇痛作用，其抗炎镇痛作用机制可能与其抑制IL1与TNF产生有关.【关键词】 南虎凝胶剂；抗炎作用；镇痛作用；作用机制0引

7、言南虎凝胶剂是根据我科经验方，以南蛇藤为主药，虎杖、没药为臣药和佐药,提取各药主要有效成分，按一定比例配制成的凝胶剂. 南蛇藤具有清热解毒、祛风除湿、活血消肿的功效，现代药理研究显示南蛇藤中南蛇藤素、扁蒴藤素具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用1. 虎杖清热祛湿，现代药理研究表明虎杖具有抗氧化、清除自由基，调节免疫功能等作用2. 没药能散瘀消肿止痛，是治疗外伤瘀血的常用药. 南蛇藤用于类风湿关节炎等疾病的治疗已有一定历史，但还没有外用剂型的报道. 我们采用分散性好、黏附力强、稳定性好的凝胶剂剂型3，不仅可以保证药效作用持久，而且应用方便. 本实验用动物疼痛和炎症模型,对南虎凝胶剂的抗炎镇痛作用及其作用

8、机制进行了实验研究.1材料和方法1.1材料健康成年雌性昆明种小鼠30只，体质量1721 g，健康成年雌性Wistar大鼠24只，体质量150200 g，由南方医科大学实验动物中心提供. 南虎凝胶剂，由南方医科大学中医风湿科与南方医科大学中药新药实验室研制; 空白凝胶剂，由南方医科大学中医风湿科实验室提供. 法斯通凝胶，为美纳里尼制药工业联合股份有限公司产品; 角叉菜胶、抑肽酶为Sigma公司产品. 大鼠IL1 ELISA试剂盒由博士德公司提供，大鼠TNF ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司提供.1.2方法1.2.1镇痛实验热板法: 选取体质量1721 g，基础痛阈>5 s，<6

9、0 s的雌性昆明种小鼠30只，随机分为空白对照组、南虎凝胶剂组、法斯通凝胶剂阳性对照组，每组10只. 各组分别用南虎凝胶剂、法斯通凝胶和空白凝胶0.5 mL涂抹双足. 用热板仪记录反应出现时间，即从置动物到热板上始至出现舔足时止，此段时间为热板痛阈，热板温度控制在5556. 各组分别于给药前30 min，给药后30,60和90 min测定反应出现时间，如小鼠在热板上停留60 s后仍无痛反应，按60 s计算.1.2.2抗炎实验 二甲苯致小鼠耳肿胀法选取体质量1721 g的雌性昆明种小鼠30只，随机分为空白对照组、南虎凝胶剂组、法斯通凝胶剂组，每组10只. 在小鼠右耳的前后两面分别涂布二甲苯0.0

10、3 mL，左耳不做任何处理. 各组分别于致炎前与致炎后30 min右耳涂布空白凝胶、南虎凝胶剂、法斯通凝胶剂0.1 mL . 致炎后4 h脱颈椎处死动物，剪下双耳用9 mm直径打孔器分别在耳相同部位打下圆耳片，扭力天平称质量. 计算肿胀度，比较治疗组与对照组差异情况.肿胀度（）=右耳质量-左耳质量左耳质量×100 角叉菜胶致炎大鼠足跖法选用体质量为150200 g雌性Wister大鼠24只，随机等分为3组，空白凝胶对照组、南虎凝胶剂组、法斯通凝胶剂阳性对照组. 试验前3日各组分别给予空白凝胶剂、南虎凝胶剂、法斯通凝胶剂0.5 mL涂抹双侧后肢，2次/d. 试验前晚大鼠禁食过夜. 为保

11、证体内水分的一致性，致炎前灌胃给水5 mL.  30 min后，大鼠双后足底皮下注射10 g/L角叉菜胶0.1 mL. 致炎前30 min和致炎后，各组分别于双后足跖部给于空白凝胶剂、南虎凝胶剂、法斯通凝胶剂0.5 mL. 在致炎前1 h及致炎后1,3,4和6 h采用毛细管放大法测定大鼠足跖体积，计算肿胀度，比较治疗组与各对照组的差别.百事通 肿胀度（）=致炎后足跖容积-致炎前足跖容积致炎前足跖容积×1001.2.3消炎止痛作用机制研究角叉菜胶致炎大鼠足跖组织中IL1，TNF测定按文献4. 动物分组与给药同角叉菜胶致炎大鼠足跖法. 角叉菜胶致炎后6 h腹主动脉放血法处死大鼠

12、，截取左侧后足，精密天平称质量，编号，置液氮中冷藏备用. 配制IL1，TNF提取液：精密天平称取抑肽酶350 g，吐温20 0.175 g，苯甲基磺酰氟化物0.498 g，加入350 mL中性PBS溶液中，冰箱冷藏备用. 取出冷冻的大鼠左侧足爪，冰浴下剪碎成沫状，置试管中，按每克组织加入4 mL IL1和TNF提取液，置0冰箱中浸泡4 h后取出浸泡液，低温离心机5000 g离心15 min，吸取上清液1 mL， -70保存备用. 取出炎性组织提取上清，室温解冻，测定IL1时，用样本稀释液作12稀释. 测定TNF时，用提取上清原液. 按大鼠IL1 ELASI试剂盒及大鼠TNF ELISA试剂盒操

13、作步骤进行.统计学处理：检测所得数据用x±s表示，Tab 1, 3采用重复测量数据的方差分析，Tab 2, 4经方差齐性检验，方差不齐，采用KruskalWallis Test做数据分析. 数据统计分析均应用SPSS 10完成.2结果2.1镇痛作用3组痛阈值比较差异有显著性意义(P=0.02), 基础痛阈值与不同时间痛阈值比较差异有显著性意义(P=0.005). 给药后1.0，1.5 h与基础痛阈值及给药后0.5 h比较差异有显著性意义，给药后1.5 h与给药后1.0 h比较差异有显著性意义（P=0.005，Tab 1）.表1南虎凝胶剂对热刺激小鼠痛阈值的影响（略）2.2抗炎作用 致

14、炎后,各组小鼠右耳均可见高度红肿，南虎凝胶剂组与法斯通凝胶组耳肿胀度与空白对照组比较(P=0.000,Tab 2). 南虎凝胶剂组与法斯通凝胶组耳肿胀度明显低于空白对照组. 南虎凝胶剂组、空白对照组及法斯通凝胶组3组足跖肿胀度差异有显著性意义（P=0.000），不同时间测得足跖肿胀度间差异有显著性意义（P=0.000），4个不同时间测得的足值肿胀度，除致炎后1 h与致炎后3 h差异无显著性意义外(P=0.354),其余均差异均有显著性意义(P<0.05, Tab 3).表2南虎凝胶剂对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（略）表3南虎凝胶剂对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响（略）2.3对角叉菜胶致大鼠炎

15、症足组织提取液内IL1，TNF活性的影响南虎凝胶剂组炎性组织提取液中IL1含量与空白凝胶对照组、法斯通凝胶组比较(P<0.05)，南虎凝胶剂组与空白凝胶对照组比较(P<0.05). 南虎凝胶剂组炎性组织提取液中TNF含量与空白凝胶对照组、法斯通凝胶组比较(P<0.05,Tab 4). 南虎凝胶剂组TNF活性明显低于空白凝胶对照组.表4南虎凝胶剂对角叉菜胶致大鼠炎症足组织提取液内Il1，TNF活性的影响（略）3讨论炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子的防御反应，是由损伤因子引起的组织损伤. 炎症损伤以血管反应为中心,局部血流适当的加速和液体渗出，有利于稀释、限制和消除损伤因子

16、，清除坏死组织，有利于组织的再生和修复.但过度的变性、渗出、坏死或异常的肉芽增生反应等对机体会造成不同程度的损伤. 细胞因子在炎症的发生、发展过程中有重要的作用，其中IL1和TNF是促进炎症反应的重要介质. 在一些疾病的发生发展中炎症是重要的环节,其治疗的关键也是抑制炎症的发生发展,比如类风湿性关节炎的治疗中药南蛇藤对类风湿性关节炎有明确的治疗作用，但全身给药毒副作用大，胃肠道刺激明显，经皮给药不仅可以减少南蛇藤对胃肠道的刺激，降低其毒副作用，而且可以增加药物局部浓度，提高制剂的生物利用度. 目前还没有其外用剂型的报道. 南虎凝胶剂是根据我科经验方，以南蛇藤为主药，虎杖、没药为臣药和佐药，提取

17、各药主要有效成分，按一定比例配制成的凝胶剂. 本研究发现在以血管通透性为主要改变的急性炎症模型实验中,南虎凝胶剂能显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀及角叉菜胶致大鼠足爪肿胀炎症反应. 南虎凝胶剂抑制二甲苯致小鼠耳肿胀的作用优于法斯通凝胶. 抑制角叉菜致大鼠足跖肿胀炎症反应起效较法斯通凝胶慢，但3 h后作用优于法斯通凝胶. 热板法是筛选中枢镇痛药的有效方法5，南虎凝胶剂能明显延长热刺激小鼠痛阈值,其作用明显优于法斯通凝胶，表明南虎凝胶剂具有明显的中枢性镇痛作用. 角叉菜胶致炎大鼠足跖炎性组织提取液中，南虎凝胶剂组IL1与TNF活性明显低于空白对照组与法斯通凝胶组，提示南虎凝胶剂可能是通过抑制IL1与TN

18、F活性而达到消炎止痛作用.总之，南虎凝胶剂对动物炎症及疼痛模型具有明显的抗炎镇痛作用, 为南虎凝胶剂的临床应用提供了实验依据，同时也为南蛇藤外用制剂的开发提供了理论依据.【参考文献】1 惠斌,吴勇杰,王鸿,等. 扁蒴藤素对急性实验性炎症的作用及其机制的研究J. 中国药理学通报, 2003；19(6)：656-659.Hui B, Wu YJ, Wang H, et al. The Study on the treatment effects on acute experiment inflammation and mechanism of pristimerinJ. Chin Pharmacol Bull, 2003;19(6):65