浅论磁性脂质超声微泡造影剂的制备及影像增强的实验研究

1、浅论磁性脂质超声微泡造影剂的制备及影像增强的实验研究         【摘要】  目的：探讨自制磁性脂质微泡超声造影剂在体外的基本特性及体内的影像增强效果，为研制既能在超声诊断中使影像增强，又能对肿瘤进行热疗的超声造影剂提供理论基础和实验依据。方法：（1） 采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米材料，机械振荡法制备磁性脂质微泡。（2） 马尔文粒径测量仪测量磁性脂质微泡粒径，血球计数板测量浓度，扫描电镜及能谱分析对其形态和成分进行分析。（3） 将已制备的磁性脂质微泡原溶液放入4 冰箱里储存2周后观察其形态和

2、粒径的变化。（4） 大型彩超仪评价其在兔肝脏的显像效果。（5） 分别将含有不同浓度磁性纳米粒子的脂质微泡置于频率230 kHz、输出电流30 A的SPG06A高频磁感应加热设备平板线圈上加热1 h，观察其体外升温情况。结果：此微泡平均粒径为1 127 nm，浓度为3×109ml1。在4 冰箱中放置2周后，其形态和粒径未发生明显改变。经耳缘静脉注入兔肝脏后，肝实质回声可见明显增强。一定浓度的磁性脂质微泡在一定磁场作用下具有升温恒温的特性，温度可恒定在4262 之间。结论：此磁性脂质微泡造影剂粒径小，性质稳定，影像增强效果好，在磁场作用下具有升温恒温能力，为今后临床的进一步应用提供了实验

3、依据。 【关键词】  脂质微泡磁性纳米粒子影像增强   Abstract：Objective  To study the characteristics of selfmade magnetic lipid microbubble ultrasound contrast agent in vitro and image contrast enhancement in vivo and provide the evidence of theory and experiment for making the ultrasound microbubble pr

4、oviding image enhancement and hyperthermia to the tumor.Methods  (1) Fe3O4 magnetic nanoparticles and magnetic lipid microbubble were prepared by chemical coprecipitation technique and mechanical vibration technique.(2) The surface morphology,size distribution and concentration of the contrast

5、agent were measured by Malvern,at the same time the appearance and composition was analyzed by SEM and EDS.(3) Morphology and size of the lipid microbubble saved in refrigerator at 4  were observed after two weeks.(4) Rabbits were examined to observe the enhancement time and intensity in liver

6、using color ultrasound.(5) Thermodynamic test was used to observe temperature change of various doses of Fe3O4 magnetic lipid microbubble under alternating magnetic field(AMF).Results  The selfmade magnetic lipid microbubble were well shaped,with a mean diameter of 1127 nm and at a concentratio

7、n of 3×109ml1.The morphology and size of the lipid microbubble in refrigerator with 4 were consistent with the previous ones.The prepared Fe3O4 magnetic lipid microbubble raised the temperature and maintained it at 4262 in certain magnetic field.Conclusion  The magnetic lipid microbubble s

8、teadily and conspicuously functions as a contrast enhancer that provide dependable guarantee for clinic application in future.   Key words：lipid microbubble； magnetic nanoparticle； image contrast enhancement随着分子生物学和超声造影技术的不断发展，超声造影剂不仅可作为影像对比增强剂用于实质器官的显像，还可以作为药物和基因的载体而起到靶向治疗的作用1。本研究旨在利用纳米技术

9、和传统的超声微泡制备技术相结合的方法研制出一种新型的磁性脂质微泡超声造影剂，并检测其体外基本特性和体内显像情况，为今后实现将该微泡造影剂用于肿瘤的影像诊断和治疗（如靶向化疗、基因治疗、热疗等）提供实验依据。1 材料与方法1.1 试剂DPPE(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱) (Sigma公司)，吐温80、甘油、丙二醇、葡萄糖、FeCl2、FeCl3、氨水(上海化学试剂有限公司)，SF6气体(南京特种气体公司)。1.2 仪器机械振荡仪（重庆影像研究所），激光粒度分析仪(MALVERN，英国)，磁力搅拌器（荣华仪器制造有限公司），扫描电镜(JEOL JSM6360LV，日本)

10、，能谱仪（Thermo NORAN, antage，美国），彩色超声诊断仪（PHILIPS，德国），广口瓶。 1.3 实验方法1.3.1  Fe3O4磁性纳米材料的制备及表征 采用化学共沉淀法2，Fe3+Fe2+按53的比例分别加入100 ml溶液于烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌下滴加氨水，待溶液中出现沉淀物并且该沉淀物由红褐色转变为黑色时停止滴加氨水，继续搅拌30 min后于80 水浴中熟化，弃上层废液，用去离子水冲洗生成物后真空干燥备用。用扫描电镜和能谱仪对其形态和成分进行分析。1.3.2 磁性脂质微泡的制备和性质检测 将准确称取的DSPC、DPPE、

11、磁性纳米材料、吐温80和葡萄糖等为主要成分的水合液按一定比例混合入3 ml的小西林瓶，用SF6气体置换溶液上方的空气，盖紧盖子后将小西林瓶放入机械振荡器中揺振45 s，静止数分钟后用PBS稀释，使用马尔文测量仪检测其粒径分布，血球计数板测量其浓度，倒置显微镜观察其形态特征，扫描电镜对其形态和成分进行鉴定。1.3.3 兔肝脏显影实验 采用20%的乌拉坦5 ml·kg1经耳缘静脉将兔子麻醉后，经耳缘静脉团注0.1 ml·kg1的浓度为3×109 ml1的磁性脂质微泡溶液，即刻追注1ml的生理盐水。采用Philips彩超诊断仪，以高频探头对兔肝进行造影，用超声

12、影像工作站储存动态造影图像。1.3.4 磁性脂质微泡体外升温实验 将磁性脂质微泡用1×PBS溶液配制成含Fe3O4浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5 g·L1的溶液，各取5 ml入25 mm平底试管中,分别置于频率230 kHz、输出电流30 A的SPG06A高频磁感应加热设备平板线圈上加热1 h，起始室温20 ，试管底距高频磁感应加热线圈中心0.5 cm,每隔5 min用TM 902C数字测温仪测温1次，以时间为横坐标、温度为纵坐标绘制Fe3O4纳米磁流体的升温曲线。2 结 果2.1 Fe3O4磁性纳米粒的表征扫描电镜示Fe3O4磁性纳米粒呈细颗粒状外观，

13、大小均一，粒径大小为15 nm,散在分布（图1）；表面能谱分析(图2)示磁性纳米粒样品中只含有Fe和O两种元素。2.2 磁性脂质微泡造影剂的表征制备的磁性脂质微泡光镜下呈圆球形外观(图3)，外包被一层脂质膜，内充有透亮的SF6气体，分散度好，马尔文粒径测量仪示平均粒径为1127 nm。扫描电镜图(图4)见磁性脂质微泡近似圆球形，表面能谱分析结果(图5)见磁性脂质微泡中含有P、O、Fe等元素,其中P为脂质成分，Fe、O为磁性材料的成分，证实磁性脂质微泡已制备成功。2.3 正常兔肝影像增强实验结果注射磁性脂质微泡3 s后肝血管内出现造影剂充填,6 s后肝实质回声出现增强,710 min达高峰,10

14、 min后仍可见较明显增强（图6）。2.4 体外升温实验结果当磁场强度一定时，磁性脂质微泡在磁场作用下，其升温能力与Fe3O4磁性纳米粒子浓度呈正相关，浓度越大升温能力越强、温度上升越快，但具有共同的规律：在作用前30 min内升温迅速，3050 min升温平缓，50 min后温度几乎不再上升而恒定在之间（图7）。3 讨论超声造影剂以其增强实质器官灰阶显像的特性而被广泛应用于临床肿瘤的影像诊断中。不仅如此，利用脂质微泡在超声介导下产生的生物学效应，还可大大加强携载药物或基因的脂质微泡的靶向释放及基因的转染和表达。       

15、;  Miller等3指出,超声微泡作为一种人为的空化核，增加了血液里空化核的密度，降低了声空化的阈值，加强了超声空化效应。空化效应所产生的强大冲击波、内切力、微速流使临近的毛细血管通透性增加，组织细胞膜出现可逆性小孔4，这就为基因的转染和药物的靶向释放提供了有利条件。为了实现微泡造影剂的诸多应用及潜在价值，一些学者致力于制备出安全性高、靶向性好、多功能的超声微泡造影剂。超声造影剂自诞生以来不断发展，已从无稳定膜结构的气体、蛋白质和多糖类为外壳的空气微泡造影剂发展到以脂质和多聚化合物为外壳、氟碳气体为核心的微泡造影剂。磁性微泡造影剂是将磁性纳米材料和脂质微气泡相结合而研制出的一种新型

16、造影剂。其目的是制备出兼具影像增强和靶向热疗作用的微泡。本研究的特点是利用磁性纳米材料的磁感应加热特性2，使制备出的磁性微泡既具有影像诊断功能，又可对肿瘤进行靶向热疗。各项指标的检测证实此造影剂已制备成功。超声造影剂特异性成像技术5的主要原理是利用声波对气体反射比对液体大近1 000倍的原理及微泡的非线性声学效应，通过声衰减、声速的改变和增强后散射等方式改变声波与组织间的吸收、反射和折射等相互作用,使超声回声增强,从而提高灰阶成像的对比分辨率和空间分辨率。本研究制备出的磁性微泡造影剂经兔耳缘静脉注入兔血液系统，当此造影剂到达兔肝时，可增强视频强度和多普勒血流信号，使肝实质影像显着增强。根据超声

17、成像原理，在超声场下，包有磁性纳米粒子的微泡声振幅度要小于单纯的脂质微泡，产生的回波信号大于单纯的脂质微泡，因此包有磁性纳米粒子的微泡对实质器官的增强效应要更显着6。   本实验采用改良的化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒，该方法制备技术成熟，应用范围广泛。在制备过程中优化了反应混合液中Fe3+和Fe2+的比例和反应体系的pH值，此二者是制备出纯度高、粒径小的磁性Fe3O4纳米粒的关键。考虑到制备过程中溶液与空气的接触存在部分Fe2+氧化为Fe3+的因素，可适当增加Fe2+的比例7。为了减少反应过程中产生的氧化现象，提高产物的纯度，在生产过程中采用了氮气保护措施。有研究表

18、明8，反应溶液的pH值过高或过低均会影响所制备的磁性纳米粒子的特性。在实验中发现，当滴加氨水至反应体系的pH值为9时，制备出的纳米粒子效果最好。本研究所制备的纳米粒子为黑色粉末状，在磁铁或者磁场作用下可见明显的磁力线。在扫描电镜下观察呈球形外观，散在分布。表面能谱分析发现此纳米粒只含Fe、O两种元素，且此两种元素的质量百分比与Fe3O4中Fe、O的百分比一致。本实验采用机械振荡法制备磁性脂质微泡，此微泡成膜材料为合成磷脂，其中包裹有磁性纳米粒子。研究表明，磁性纳米粒子具有很好的生物相容性9，脂质微泡成膜材料为合成磷脂，膜内填充SF6气体，该气体无毒且在血循环中性质稳定。此微泡粒径小于2 m，可

19、自由通过肺循环，防止肺栓塞形成。微泡性质稳定，在4 冰箱中放置2周后，前后对比发现其形态及粒径未发生明显改变。体外升温实验显示，在磁场强度一定的条件下，磁性脂质微泡的浓度越高，其温度上升得越快，当温度升到一定程度时，温度不再随时间而改变。这是由于微泡中磁性纳米粒子吸收电磁波所产生的热和散发到环境中的热相等而使温度保持不变。我们将一定浓度的包有磁性纳米粒的脂质微泡悬浮液放在交变磁场中作用时，发现达到稳定时的温度在4262 之间（图7），此温度为肿瘤热疗的有效温度。因此，我们可以利用不同浓度磁性脂质微泡在一定磁场下的升温恒温来实现对肿瘤的热疗。随着进一步的研究，磁性微泡造影剂不仅可用于肿瘤的临床诊

20、断，同时也为超声造影剂对肿瘤进行热疗等提供了可能性。目前，该磁性超声微泡造影剂正处于基础研究中，真正的面向临床应用还有很长的路要走。【参考文献】  1ter HAAR G R.Ultrasonic contrast agents: safety considerationsJ.Eur J Radiol,2002,41(3): 217221.2YAN S Y,ZHANG D S,GU N,et al.Therapeutic effect of Fe2O3 nanopaticles combined with magnetic fluid hyperthermia on cultured liver cancer cells and xenograft cancersJ.J Nanosci Nanotech,2005,5(8): 11851192.3MILLER M