211植物细胞工程的基本技术

1、专题2 细胞工程细胞工程细胞工程 指应用细胞生物学和分子生物学的原理和指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。技术。 应用的原理和方法应用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞整体水平细胞整体水平或细胞器水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获细胞内的遗传物质

2、或获得细胞产品得细胞产品根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为细胞工程分类：细胞工程分类：植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程2.1.1植物细胞工程的基本技术为什么植物的一个花瓣就可以培育为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株呢？出完整的植株呢？ 微型繁殖的菊花微型繁殖的菊花一、植物组织培养一、植物组织培养（一）原理：细胞的全能性（一）原理：细胞的全能性 1 1、生物体的细胞具有使后代细胞形、生物体的细胞具有使后代细胞形成完整生物体的潜能，细胞的这种特性成完整生物体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。叫做细胞的全能性。 生物体的每一个细

3、胞都包含有该物生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的种所特有的全套遗传物质全套遗传物质，都有发育成，都有发育成为完整个体所必需的为完整个体所必需的全部基因全部基因，从理论，从理论上讲，生物体的每一个上讲，生物体的每一个活细胞活细胞都应该具都应该具有全能性。有全能性。受精卵受精卵 卵细胞（生殖细胞卵细胞（生殖细胞) ) 体细胞体细胞2 2、细胞全能性大小的比较：、细胞全能性大小的比较：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞（核）（核） 动物细胞由于高度抑制不易表达，但核仍具动物细胞由于高度抑制不易表达，但核仍具有全能性。因此，要想让动物体细胞的核表有全能性。因此，要想让动物体细胞的核表现出全能性，

4、则需将核取出，放入去核的卵现出全能性，则需将核取出，放入去核的卵（或卵母）细胞中，构成重组细胞。（或卵母）细胞中，构成重组细胞。生物体内：生物体内：细胞不表现全能性细胞不表现全能性-基因在特定条件下基因在特定条件下 选择表达结果选择表达结果离体状态：离体状态：在一定的营养物质、激素和其它条件下在一定的营养物质、激素和其它条件下 -表现全能性表现全能性生物表现全能性条件生物表现全能性条件3 3、生物体内的细胞为什么没有表现出全、生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？能性，而是分化成不同的组织器官？原因：原因： 离体培养时，脱离了母体的限制离体培养时，脱离了母体的限制二、

5、植物组织培养过程关键词：关键词：外植体、脱分化、再分化、愈伤组织外植体、脱分化、再分化、愈伤组织 离体器官离体器官 组织或细胞组织或细胞脱分化脱分化愈伤愈伤组织组织再分化再分化根根芽芽植植物物体体注意事项：1 1、必要条件：细胞离体、一定的营养物质、激素、必要条件：细胞离体、一定的营养物质、激素和和一定的温度、空气、无菌环境、适合的一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适适时光照时光照等等其他外界条件。其他外界条件。2 2、脱分化的概念。、脱分化的概念。3 3、脱分化过程受植物激素等的影响，最重要的是、脱分化过程受植物激素等的影响，最重要的是细胞分裂素和生长素，激素还能促进愈伤组织再细胞分裂

6、素和生长素，激素还能促进愈伤组织再分化并可通过两种激素的比例来调控根芽的分化分化并可通过两种激素的比例来调控根芽的分化和形成。和形成。细胞分裂素细胞分裂素 生长素比例高生长素比例高, ,有利于芽分化形成有利于芽分化形成, ,细胞分裂素细胞分裂素 生长素比例低生长素比例低, ,有利于根分化形成有利于根分化形成, ,三、植物组织培养实例 1 1、原理、原理2 2、材料用具、材料用具3 3、植物组织培养的培养基：含有植物生长、植物组织培养的培养基：含有植物生长所需的全部营养成分，供组织培养植物生所需的全部营养成分，供组织培养植物生长的基质长的基质（1）营养成分：）营养成分：矿质元素：大量元素及部分微

7、量元素，最重矿质元素：大量元素及部分微量元素，最重要的是要的是N源（蛋白质组成元素）源（蛋白质组成元素）碳源：碳源：2%5%的蔗糖，植物细胞赖以生长的蔗糖，植物细胞赖以生长的重要成分；的重要成分； 维生素（维生素（VitC、VitB1）：促进离休组织生）：促进离休组织生长长 生长调节物质：如生长素、细胞分裂素和赤生长调节物质：如生长素、细胞分裂素和赤霉素等；霉素等；有机添加剂：如氨基酸、酰氨等，对植物细有机添加剂：如氨基酸、酰氨等，对植物细胞和组织分化有一定促进作用。胞和组织分化有一定促进作用。（2 2）介质：）介质： 琼脂：从一种海藻中提取出的一种多琼脂：从一种海藻中提取出的一种多糖类物质，

8、其溶点在糖类物质，其溶点在4040左右，溶解状态下左右，溶解状态下可使营养物质溶解均匀分布其中，冷却成固可使营养物质溶解均匀分布其中，冷却成固态，并搁成培养基平面，且不被微生物分解态，并搁成培养基平面，且不被微生物分解4 4、方法步骤：、方法步骤：（1 1）外植体消毒）外植体消毒（2 2）培养基灭菌）培养基灭菌（3 3）接种（选取形成层细胞）接种（选取形成层细胞）（4 4）培养条件：无菌条件下进行）培养条件：无菌条件下进行 （5 5）过程）过程离体器官离体器官 组织或细胞组织或细胞脱分化脱分化愈伤愈伤组织组织再分化再分化根根芽芽植植物物体体2326 2326 避光，诱避光，诱导愈伤组导愈伤组织

9、形成织形成见光，见光，诱导生诱导生根芽根芽植物材料消毒植物材料消毒接种到诱导培养基接种到诱导培养基诱导出愈伤组织诱导出愈伤组织愈伤组织转接到愈伤组织转接到继代培继代培养基养基上上得到大量的愈伤组织得到大量的愈伤组织愈伤组织接种到愈伤组织接种到分化分化 培养基培养基上上可以不继代培养直接可以不继代培养直接诱导分化诱导分化分化出幼苗分化出幼苗幼苗接种到幼苗接种到生根培养基生根培养基上上完整植株完整植株若诱导出幼苗的同时若诱导出幼苗的同时也实现生根，可以省也实现生根，可以省略生根培养基略生根培养基移栽到大田移栽到大田试 管 苗 大 规 模 培 养试 管 苗 大 规 模 培 养过程过程离体的植物器官、

10、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体外植体外植体脱分化脱分化植物激素：植物激素：细胞分裂素、生长素细胞分裂素、生长素再分化再分化植物组织培养植物组织培养条件植物组织培养条件： 含有全部营养成分的培养基、含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、一定的温度、空气、无菌环境、适合的适合的PHPH、适时光照适时光照等。等。小结小结地上地上地下地下2020世纪世纪6060年代，有的科年代，有的科学家提出这样一种设想：学家提出这样一种设想：让番茄和马铃薯杂交，让番茄和马铃薯杂交，培育出一种地上结番茄培育出一种地上结番茄果实、地下结马铃薯块果实、地下结马

11、铃薯块茎的植物。茎的植物。19781978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(Melchers)(Melchers)等首次获得等首次获得了番茄和马铃薯的了番茄和马铃薯的属间属间体细胞杂种体细胞杂种“Potamato“Potamato”。 白菜白菜甘蓝甘蓝白菜白菜 甘蓝甘蓝问题问题?细胞融合细胞融合白菜和甘蓝两种植物之间存白菜和甘蓝两种植物之间存在着在着 隔离，不能进行传隔离，不能进行传统的统的 杂交。如何获得如杂交。如何获得如图这样的图这样的“白菜白菜甘蓝甘蓝”植植株呢？株呢？生殖生殖有性有性将将 种植物的种植物的 细胞，在一定条件下细胞，在一定条件下 成成杂种杂种细胞，并通过细胞，并通过 技术将杂种细胞技

12、术将杂种细胞培育成新的植物体的技术。培育成新的植物体的技术。基本概念：基本概念：四、植物体细胞杂交四、植物体细胞杂交白菜白菜甘蓝甘蓝白菜白菜 甘蓝甘蓝细胞融合细胞融合不同不同体体融合融合组织培养组织培养思考讨论：思考讨论：（1 1）要想让两个来自不同植物的体细胞）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？（2 2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？）有没有一种温和的去细胞壁的方法？（3 3）一个植物细胞去除细胞壁后，剩下）一个植物细胞去除细胞壁后，剩下的是具有活力的的是具有活力的 。171918171918（4 4）如何将杂种细胞培育成

13、杂种植株？）如何将杂种细胞培育成杂种植株？原生质体原生质体 如何使两个来源不同的原生质体发生融合如何使两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞？形成了杂种细胞？杂种细胞杂种细胞愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物细胞植物细胞A A植物细胞植物细胞B B 原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B正在融合的原生质体正在融合的原生质体植物植物体细体细胞的胞的杂交杂交去壁去壁去壁（方法？）去壁（方法？）人工诱导人工诱导( (方法？方法？) )再生壁再生壁脱分化脱分化再分化再分化植物体细胞融植物体细胞融合完成的标志合完成的标志诱导植物细胞融合的方法：诱导植物细胞融合的方法：实验方法：实验方法：去

14、细胞壁的方法：去细胞壁的方法：最常用的方法是酶解法最常用的方法是酶解法物理法：离心、振动、电刺激物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG）在在温和温和的条件下用的条件下用纤维素酶纤维素酶和和果胶酶果胶酶等等分解植物细胞的细胞壁分解植物细胞的细胞壁 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞植物细胞A A植物细胞植物细胞B B 原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B杂种细胞杂种细胞正在融合的原生质体正在融合的原生质体再生壁再生壁如图所示的植物体细胞杂交过程中，若只如图所示的植物体细胞杂交过程中，若只考虑两两细胞的融合，除形成考虑两两细胞的融合，除形成ABAB型融

15、合细型融合细胞外，还能形成其他类型的融合细胞吗？胞外，还能形成其他类型的融合细胞吗？哪些类型？哪类融合细胞才是植物体细胞哪些类型？哪类融合细胞才是植物体细胞杂交所需要的杂种细胞？杂交所需要的杂种细胞？流程图中为了简化，仅画了一个马铃薯的流程图中为了简化，仅画了一个马铃薯的原生质体与一个番茄的原生质体之间的融原生质体与一个番茄的原生质体之间的融合，可真正在实际操作过程中，是把许多合，可真正在实际操作过程中，是把许多马铃薯的原生质体和许多番茄的原生质体马铃薯的原生质体和许多番茄的原生质体放在一起，让它们自由融合，再从中放在一起，让它们自由融合，再从中筛选筛选出所需的杂种细胞。出所需的杂种细胞。实例

16、实例番茄番茄- -马铃薯马铃薯 胡萝卜胡萝卜羊角芹羊角芹烟草烟草海岛烟草海岛烟草白菜白菜甘蓝甘蓝 在克服在克服远源杂交远源杂交不亲和的不亲和的障碍障碍、培育作物、培育作物新品种方面所取得的重大突破。新品种方面所取得的重大突破。 植物体细胞杂交的意义植物体细胞杂交的意义（与与有性杂交方法比较的优点）有性杂交方法比较的优点） 反馈：反馈：1 1、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化、在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需要的是不需要的A A、消毒灭菌、消毒灭菌 B B、适宜的温度、适宜的温度C C、充足的光照、充足的光照 D

17、D、适宜的养料和激素、适宜的养料和激素2 2、植物体细胞融合完成的标志是（、植物体细胞融合完成的标志是（ ）A A、产生新的细胞壁、产生新的细胞壁 B B、细胞膜发生融合、细胞膜发生融合C C、细胞质发生融合、细胞质发生融合 D D、细胞核发生融合、细胞核发生融合CA3 3、下列植物细胞的全能性在提供了适宜条件、下列植物细胞的全能性在提供了适宜条件的情况下最易表达的是（的情况下最易表达的是（ ）A A、枝条上的一个芽、枝条上的一个芽 B B、柱头上的花粉、柱头上的花粉C C、胚珠中的珠被细胞、胚珠中的珠被细胞 D D、根尖分生区细胞、根尖分生区细胞4 4、能刺激愈伤组织形成的激素是（、能刺激愈

18、伤组织形成的激素是（ ）A A、细胞分裂素、细胞分裂素 B B、赤霉素、赤霉素C C、生长素和赤霉素、生长素和赤霉素 D D、细胞分裂素和乙烯、细胞分裂素和乙烯 B B A A5 5、植物体细胞杂交要先除去细胞壁的原因、植物体细胞杂交要先除去细胞壁的原因（ ）A A、植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁、植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁B B、细胞壁使原生质体失去活力、细胞壁使原生质体失去活力C C、细胞壁阻碍了原生质体的融合、细胞壁阻碍了原生质体的融合D D、细胞壁不是原生质体的组成部分、细胞壁不是原生质体的组成部分C C考点一考点一 植物组织培养及细胞全能性植物组织培养及细胞全能性1.1.

19、操作流程及培养条件操作流程及培养条件 (1)(1)操作流程操作流程 (2)(2)培养条件：营养物质培养条件：营养物质( (水、无机盐、蔗糖、氨水、无机盐、蔗糖、氨 基酸和有机酸等基酸和有机酸等) )、激素、激素( (如细胞分裂素、生长素如细胞分裂素、生长素 等等) )及其他条件及其他条件( (无菌、适宜的温度和无菌、适宜的温度和pHpH等等) )。 提醒提醒 幼嫩的组织脱分化较为容易幼嫩的组织脱分化较为容易, ,如茎尖、如茎尖、 根尖、形成层细胞易脱分化根尖、形成层细胞易脱分化, ,而植物的茎、叶和成而植物的茎、叶和成 熟的组织则较难。熟的组织则较难。 对外植体要进行消毒处理对外植体要进行消毒

20、处理, ,而对各种器械要彻底而对各种器械要彻底 灭菌。灭菌。 植物组织培养中用到的有机碳源一般为蔗糖植物组织培养中用到的有机碳源一般为蔗糖, ,用用 葡萄糖也可以葡萄糖也可以, ,但后者的成本高。但后者的成本高。 诱导愈伤组织再分化形成胚状体或丛芽及生根诱导愈伤组织再分化形成胚状体或丛芽及生根 的过程中的过程中, ,要进行换瓶处理要进行换瓶处理, ,以改变培养基中的激以改变培养基中的激 素配比及浓度。素配比及浓度。2.2.脱分化和再分化的比较脱分化和再分化的比较比较内容比较内容脱分化脱分化再分化再分化过程过程外植体外植体愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗形成体特点形成体特点排列疏松、高度

21、液泡排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞化的薄壁细胞有根、芽有根、芽需要条件需要条件a.a.离体离体b.b.适宜的营养适宜的营养c.c.生长素生长素/ /细细胞分裂素的比胞分裂素的比例适中例适中d.d.不需光不需光a.a.离体离体b.b.适宜的营养适宜的营养c.c.生长素生长素/ /细细胞分裂素的比胞分裂素的比例高或低诱导例高或低诱导生芽或生根生芽或生根d.d.光照光照 提醒提醒 愈伤组织再分化形成植物幼苗时愈伤组织再分化形成植物幼苗时, ,需光照需光照 处理处理, ,以便诱导叶绿体的形成。以便诱导叶绿体的形成。 生长素和细胞分裂素在植物体内含量很低生长素和细胞分裂素在植物体内含量很低, ,因此因此

22、 植物组织培养中常用人工合成的生长素类似物和植物组织培养中常用人工合成的生长素类似物和 细胞分裂素类似物。细胞分裂素类似物。细胞分裂素细胞分裂素/ /生长素的比例适生长素的比例适 中中, ,有利于外植体脱分化有利于外植体脱分化, ,比例升高有利于愈伤组比例升高有利于愈伤组 织再分化形成丛芽织再分化形成丛芽, ,比例降低则有利于生根。比例降低则有利于生根。3.3.原理：全能性原理：全能性 (1)(1)含义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整含义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整 个体的潜能。个体的潜能。 (2)(2)物质基础：生物的每一个细胞都包含有该物种物质基础：生物的每一个细胞都包含有该物

23、种 所特有的全套遗传物质所特有的全套遗传物质, ,都有发育成完整个体所必都有发育成完整个体所必 需的全部基因。需的全部基因。 (3)(3)在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因 基因在特定的时间和空间条件下选择性表达基因在特定的时间和空间条件下选择性表达, ,细胞细胞 分化为不同的组织、器官。分化为不同的组织、器官。 (4)(4)全能性的实例全能性的实例 花药的离体培养、植物的组织培养、克隆技术等花药的离体培养、植物的组织培养、克隆技术等。考点二考点二 植物体细胞杂交植物体细胞杂交1.1.技术流程技术流程2.2.考点解读考点解读 (1)(1)植物体细胞杂交的障碍植物体细胞杂交的障碍 植物细胞都有细胞壁。根据酶的专一性原理植物细胞都有细胞壁。根据酶的专一性原理, ,用用 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。 原生质