生命体系中金属离子-今日化学讲座陈浩3

1、含咕啉环配含咕啉环配体的钴（体的钴（）配合物，咕配合物，咕啉有啉有4个吡咯个吡咯环，吡咯环环，吡咯环间由三个亚间由三个亚甲基甲基CH2-和和一个一个-碳原碳原子子直接连结。直接连结。辅酶辅酶B B1212，即，即5-5-脱氧腺苷钴胺脱氧腺苷钴胺素，是具有生物活性的天然有素，是具有生物活性的天然有机金属化合物。机金属化合物。辅酶辅酶B B1212是新陈代谢以及是新陈代谢以及DNADNA合合成有关的一系列酶反应的天然成有关的一系列酶反应的天然辅因子，在生物体内的多种分辅因子，在生物体内的多种分子内重排及核苷酸降解反应中子内重排及核苷酸降解反应中起重要作用。起重要作用。 其其Co-CCo-C键均裂产

2、生键均裂产生Co()Co()配合配合物物B B12r12r和和5-5-脱氧腺苷自由基是脱氧腺苷自由基是酶催化反应的关键步骤酶催化反应的关键步骤 。HHXCC12XCC12CC12XXCC12IIIIIIVOverall ReactionAdCH3AdCH2AdCH2AdCH31.1.钴胺素的氧化还原作用钴胺素的氧化还原作用 上述钴胺素都是反磁性物质，具有低自旋上述钴胺素都是反磁性物质，具有低自旋d6d6构型，构型，CoCo的氧化态为的氧化态为+3+3，在适当条件下，在适当条件下 ，CoCo（）可以还原为可以还原为CoCo（）或或CoCo（）。 如用弱还原剂抗坏血酸，可以使钴胺素中如用弱还原剂抗

3、坏血酸，可以使钴胺素中CoCo（） 还原为还原为CoCo（）胺素）胺素（顺磁性顺磁性），），常用常用B B12r12r表示；表示； 如用四硼氢化钠或四氢铝锂还原，则可使如用四硼氢化钠或四氢铝锂还原，则可使CoCo（）胺素进一步还原为胺素进一步还原为CoCo（）胺素）胺素B B12s12s。 2 2. 甲基转移反应甲基转移反应 B B1212重要功能是参与合成蛋氨酸，在重要功能是参与合成蛋氨酸，在B B1212作用下，作用下，可使一分子的甲基转移到另一分子上。可使一分子的甲基转移到另一分子上。 X-ray X-ray 晶体衍射分析揭示晶体衍射分析揭示底物诱导蛋白质构象发生底物诱导蛋白质构象发生的

4、变化引发了的变化引发了Co-CCo-C键的均键的均裂反应裂反应在全酶体系中在全酶体系中Co-CCo-C键均裂键均裂的速率相比于孤立的天然的速率相比于孤立的天然辅因子提高了约辅因子提高了约101012121 1倍倍为了深入了解其结构与功为了深入了解其结构与功能的关系，辅酶能的关系，辅酶B B1212及其模及其模型化合物已经被广泛地进型化合物已经被广泛地进行研究行研究 甲基丙二酸单酰辅酶甲基丙二酸单酰辅酶A A变位酶全酶结构示意图变位酶全酶结构示意图 维生素维生素B B1212在体内主要功能为通过辅酶在体内主要功能为通过辅酶B12B12参与碳参与碳的代谢作用，促进核酸和蛋白质合成，叶酸储存，的代谢

5、作用，促进核酸和蛋白质合成，叶酸储存，硫醇活化，骨磷脂形成，促进红细胞的发育与成硫醇活化，骨磷脂形成，促进红细胞的发育与成熟。熟。 B B1212最为显著的特点之一是形成烷基衍生物的能力，最为显著的特点之一是形成烷基衍生物的能力，烷基钴胺素中的烷基烷基钴胺素中的烷基R R碳原子与钴原子主要以碳原子与钴原子主要以键键合，属于有机金属化合物。一般来说，过渡金属合，属于有机金属化合物。一般来说，过渡金属键合的烷基衍生物是不稳定的，而烷基钴胺素键合的烷基衍生物是不稳定的，而烷基钴胺素则比较稳定，从而使人们去研究其稳定性。研究则比较稳定，从而使人们去研究其稳定性。研究是采取模型化合物。是采取模型化合物。

6、 豆科植物根部豆科植物根部根瘤菌根瘤菌含钼蛋白质含钼蛋白质固氮酶的催化反应固氮酶的催化反应 固氮酶来源于多种固氮微生物固氮酶来源于多种固氮微生物, ,能催化大气能催化大气中的中的N N2 2还原为还原为NHNH3 3, ,N N2 2+8H+8H+ +8e+8e- -+16MgATP+16MgATP2NH2NH3 3+H+H2 2+16MgADP+16Pi(+16MgADP+16Pi(无机磷酸盐无机磷酸盐) ) 除催化除催化N N2 2还原为还原为NHNH3 3外外, ,固氮酶还能和许多固氮酶还能和许多小分子底物作用小分子底物作用, ,没有严格的专一性。以没有严格的专一性。以下列出下列出固氮酶

7、催化反应固氮酶催化反应: : HCN+6HHCN+6H+ + +6eCH +6eCH4 4+NH+NH3 3 N N2 2O+3HO+3H+ +2eN+2eN2 2+NH+NH3 3 C C2 2H H2 2+2H+2H+ +2eC+2eC2 2H H4 4 固氮酶的组成和结构固氮酶的组成和结构 固氮酶由各种固氮微生物分离出来固氮酶由各种固氮微生物分离出来, ,均为由均为由钼铁蛋白和铁蛋白组成。钼铁蛋白和铁蛋白组成。 固氮酶的结构直到固氮酶的结构直到19931993年才基本确定：固年才基本确定：固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白这两种相对独立、氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白这两种相对独立、相互分离的金属蛋白构成

8、。相互分离的金属蛋白构成。 功能功能: :铁蛋白是依赖于铁蛋白是依赖于ATPATP供给能量的电子供给能量的电子传递体传递体, ,把电子传递给钼铁蛋白把电子传递给钼铁蛋白, ,钼铁蛋白钼铁蛋白结合底物分子并催化其还原。结合底物分子并催化其还原。铁钼蛋白结构铁钼蛋白结构 值得一提的是无机生物固氮值得一提的是无机生物固氮，现在知道现在知道固氮酶固氮酶是由铁蛋白和是由铁蛋白和钼铁蛋白构成的。在这些蛋白中钼铁蛋白构成的。在这些蛋白中，FeFe、S S、Mo Mo 都是功能元素。通都是功能元素。通过模型化合物的研究发现过模型化合物的研究发现：FeFe、MoMo蛋白蛋白的结构是由组成为的结构是由组成为 MF

9、eMFe3 3S S3 3的两个开口的两个开口“网斗网斗”口对口地被三个口对口地被三个S S原子相桥联。附图中上半部原子相桥联。附图中上半部那个那个MFeMFe3 3S S3 3( (口朝下口朝下) )的的M M为为FeFe原子原子, , 而下半部那个口朝上的而下半部那个口朝上的MFeMFe3 3S S3 3的的M M则为则为MoMo原原子子。结构中存在一个结构中存在一个由由6 6个配位不饱和个配位不饱和FeFe原子组成的三棱柱原子组成的三棱柱体，体，ReesRees等认为等认为N N2 2分分子是在三棱柱体空子是在三棱柱体空腔中与腔中与 FeFe原子形成原子形成六连六连N N2 2桥物种而活

10、化桥物种而活化并被还原的。并被还原的。图中图中的的Y Y在最先的报道中在最先的报道中是个未知配位体，是个未知配位体，现在则认为也是现在则认为也是S S原原子。子。固氮酶作用机理研究固氮酶作用机理研究 19931993年年, ,已基本确定固氮酶中铁蛋白的作用已基本确定固氮酶中铁蛋白的作用是传递电子是传递电子, ,钼铁蛋白与底物结合并还原钼铁蛋白与底物结合并还原N N2 2的催化部位的催化部位, ,即即N N2 2只有与钼铁蛋白只有与钼铁蛋白( (固氮酶中固氮酶中一组成部分一组成部分) )结合、方可被催化还原为结合、方可被催化还原为NHNH3 3。现在的问题是现在的问题是: :固氮酶的作用机理是什

11、么固氮酶的作用机理是什么? ?固氮酶这一多中心金属酶如何组装？固氮酶这一多中心金属酶如何组装？ 固氮酶的作用机理包括固氮酶的作用机理包括: :电子的传递、电子的传递、N N2 2分子的键合、催化和还原等分子的键合、催化和还原等。 1.1.电子的传递电子的传递 研究表明，在固氮酶催化研究表明，在固氮酶催化N N2 2和其他底物和其他底物的还原反应中，电子传递顺序为：的还原反应中，电子传递顺序为：（活体内）铁氧还蛋（活体内）铁氧还蛋白或黄素蛋白白或黄素蛋白 （活体外）（活体外）NaNa2 2S S2 2O O4 4 铁蛋白铁蛋白 钼铁蛋白钼铁蛋白底物底物 MgATP 目前不可能合成真正的固氮酶，只

12、能按其结构来目前不可能合成真正的固氮酶，只能按其结构来设计模型物，合成一些简单的配合物来探索理想设计模型物，合成一些简单的配合物来探索理想模型物应有的结构。模型物应有的结构。 固氮酶对底物固氮酶对底物没有没有严格的专一性，因此可以推断，严格的专一性，因此可以推断，钼铁蛋白活性中心结构不一定有非常高的专属性，钼铁蛋白活性中心结构不一定有非常高的专属性，将来也许能找到不止一种化合物具有在温和条件将来也许能找到不止一种化合物具有在温和条件下固氮的性能。目前已发现多种化合物能结合氮下固氮的性能。目前已发现多种化合物能结合氮分子并使之活化。分子并使之活化。 至今为止，人们对于固氮酶的活性中心的铁钼辅至今

13、为止，人们对于固氮酶的活性中心的铁钼辅基的认识很肤浅。只知其为含两个七原子欠完整基的认识很肤浅。只知其为含两个七原子欠完整的立方烷簇（完整的为的立方烷簇（完整的为8 8原子立方体）。一个为原子立方体）。一个为4Fe-3S4Fe-3S原子簇，另一个为原子簇，另一个为Mo-3Fe-3SMo-3Fe-3S原子簇，中原子簇，中间通过二个非蛋白的间通过二个非蛋白的S S2-2-和一个可能含有和一个可能含有O O或或N N等原等原子的未知配体子的未知配体X X桥连。桥连。 作为固氮酶模型的钼化合物主要有以下作为固氮酶模型的钼化合物主要有以下四类四类：钼钼铁铁硫原子簇；硫原子簇； 钼硫醇（包括钼钼硫醇（包括

14、钼半胱氨酸）；半胱氨酸）；钼钼二硫代氨基甲酸；二硫代氨基甲酸；钼钼氰负离子。氰负离子。 除了厌氧生物以外，一切生物都需要氧，除了厌氧生物以外，一切生物都需要氧，因此，因此，氧化还原反应氧化还原反应是生物体内的重要是生物体内的重要反应。但氧化还原反应并不仅仅局限于反应。但氧化还原反应并不仅仅局限于生物体的生物体的呼吸作用呼吸作用。光合作用光合作用，固氮作固氮作用用以及生物体内的以及生物体内的许多代谢过程许多代谢过程都涉及都涉及到氧化还原反应。到氧化还原反应。 生物体系中某些金属与配体生物体系中某些金属与配体金属金属配体配体生物体系生物体系Mn咪唑咪唑丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶FeFe卟啉，咪唑卟啉

15、，咪唑含硫配体含硫配体血红素、氧化酶、过氧化氢血红素、氧化酶、过氧化氢酶酶铁氧化还原蛋白铁氧化还原蛋白Co咕啉环咕啉环B12ZnZnNH2，咪唑咪唑（RS）2胰岛素、碳酸酐酶胰岛素、碳酸酐酶醇脱氢酶醇脱氢酶PbSH氨基乙酰丙酮脱水酶氨基乙酰丙酮脱水酶Ni半胱氨酸半胱氨酸脲酶脲酶Cu咪唑、酰胺咪唑、酰胺白蛋白白蛋白Selective metal ion recognitionChemists still do not possess enough knowledge/skill to design molecules thatrecognize metal ions with high sele

16、ctivity and sensitivity?Nature has evolved metalloregulatory proteins that can perform these functions. The archetype of the MerR family of transcriptional activators is the regulator of Gram-negative mercury resistance (mer) Target molecule binding to the protein induces a conformational change tha

17、t sends a signal to activate metal detoxification or efflux systems MerR family proteins regulate bacterial resistance to toxic metal ions, organic drugs and radicals Research from Walsh, C. T.; OHalloran, T. V.; Summers, A. O.; Brown, N. L. and othersMerR proteins are highly sensitive and selective

18、It is known that MerR recognizes Hg(II)at 10-8 M concentration.Changela. A. et al. Science 2003, 301, 1383-1387ZntR binds Zn(II) at 10-15 M, and CueR binds Cu(I) at 10-21 M(from OHallorans reports).MerR proteins can be found in almost every bacterial genome; the functions ofthese proteins are mostly

19、 not characterized. Coupling the sensory event of MerR protein with abiotic signal should afford highly sensitive and selective bioprobesA: MerR bound to DNA and RNA polymerase recruited but not able to form an open complex. B: The conformational change induced by Hg(II) binding to the ternary compl

20、ex and initiation of transcription. C: The hypothetical repression of the promoter by displacement of HgMerR2 with MerD at low Hg(II)BmrR/DNA complex structureBrennan, R. G. et al. Nature 2001, 409, 378-382.Structural information on MerR family proteinsThe two central base pairs are brokenIt appears

21、 that all MerR proteins distort their corresponding promoter DNA andbreak two central base pairs upon binding to the target metal ions or small molecules.A general strategy1. M can be metal ions, organic drugs and radicals. This is a general strategy to construct biosensors that selectively detect a

22、 range of analyts.2. The fluorescence technique also offers a powerful method to study substrate preferences, substrate binding thermodynamics and kinetics of MerR proteins.MMerR proteinsME. coli CueR as the first exampleEscherichia coli CueR is a MerR type metal-regulatory protein that controls the

23、 intracellular coinage ions concentration.Changela. A. et al. Science 2003, 301, 1383.A CueR-based biosensor for Cu(I) and Ag(I)Cu(I)Ag(I)The biosensor is at least 200-fold more selective towards Cu(I) and Ag(I)A MerR-based biosensor can selectively detect 10-7 molar concentrations of Hg(II)Taking a

24、dvantage of excimers400500600100200300400500Wavelength (nm)Intensity (a.u.)5- CCTTGACTCCGTACA AGTACGGAAGTCCC -3OOOOOOMerRHg2+350 nm480 nmAb =3- GGAACTGAGGCATGT TCATGCCTTCAGGG -5AbAb5- CCTTGACTCCGTACA AGTACGGAAGTCCC -3MerR350 nm380 nm3- GGAACTGAGGCATGT TCATGCCTTCAGGG -5AbAbHg2+=ExcimerWith Hg2+A 2-am

25、inopurine-based reporterNNNNNDNAHHHUnpaired/distorted 2AP emits strong fluorescence2AP TDNA-2Pb2+DNA-2NNOOCH3DNANH2NNNNDNANHNOOCH3ATA# = 2-Aminopurine3-ACTGAGATATCATTGATCTCCCACA-5#315 nm380 nm315 nm380 nm5-TGACTCTATAGTAACTAGAGGGTGT-3PbrR6915-TGACTCTATAGT ACTAGAGGGTGT-33-ACTGAGATATCA TGATCTCCCACA-5#P

26、brR691DNAPb2+PbrR691 binds lead(II) 1000-fold more selective thanother metal ions!CadR in Pseudomonas putidaPseudomonas putida is Gram-negative soil micoorganism. It is capable ofdecontaminating organic substances and also possesses cadmium(II) resistance.A membrane-bound cadmium(II) efflux pump Cad

27、A is regulated by a MerR familyprotein CadR - Cooksey, D. A. et al. App. Environ. Microbiol. 2001, 67, 1437.CadR Molecular Weight16647.6 (147Amino Acid) CadR sequence alignment with other MerR proteinsCadR is more selective towards Cd2+ by ITC!CadR Kd for Cd2+ 5.24 x 10-27M(KCdS=1019.3, KCds-CadR=1.

28、91x107, Ks=1.91x1026) for Zn2+ 2.24 x 10-21M (KZnS=1015, KZns-CadR=4.47x105, ks=4.47x1020)But ITC cant detect binding signal between other metal ion with CadR0.00.51.01.5-10-8-6-4-20-0.10-0.050.000.050.100.150.200.00000000033.33333333366.666666667100.000000000133.333333333166.666666667200.000000000T

29、ime (min)礳al/secData: CdTCCadR_NDHModel: OneSitesChi2/DoF = 1.135E5N0.7640.012K3.65E65.9E5H-8443181S1.63Molar Ratiokcal/mole of injectant0.00.51.01.52.0-8-6-4-20-0.10-0.08-0.06-0.04-0.020.000.020.040.060.080.00000000033.33333333366.666666667100.000000000133.333333333166.666666667200.000000000Time (m

30、in)礳al/secData: ZnTCCadR_NDHModel: OneSitesChi2/DoF = 1.023E5N0.4170.038K5.35E51.1E5H-1.157E41.38E3S-12.3Molar Ratiokcal/mole of injectanttruncate 10 amino acid from C terminal of CadR, CadR lost 10 fold Cd(II)binding affinity, but doesnt effect Zn binding affinity. Pb-S specfical transition at 340n

31、mIt means the core structure of Co-CadR is Cys4 or Cys3O(N).Krizek BA, Berg JM. Inorg. Chem. 1993,32,937-940Anti-titration experiments and competitiveexperiments show CadR selective binding CdZnPbCoNi by ICP-MS(data not show)Co-S specfical transition at 310nm, 350nm, 580nm and 685nm.CoCadR and PbCad

32、R UV-vis Spectrum3203403603804004200.000.050.100.150.200510152025300.020.040.060.080.100.120.14AbsorbanceCPb2+ (uM)Pb2+ AbsorbanceWavelength113Cd-CadR NMR studyEXEFS of Zn-CadRWho is the last ligand?EXEFS (Extended X-ray Emission Fine Structure) 3-GAACTGGGATATCACCGATGTCCCACAAG-55-CTTGACCCTATAGTGGCTA

33、CAGGGTGTTC-5#350 nm445 nm350 nm445 nmCd2+CadRCadR#GGCd2+?3-GAACTGGGATATCA GATGTCCCACAAG-55-CTTGACCCTATAGT CTACAGGGTGTTC-5CCCadmium(II) recognition by CadRNo DNA distortion!XGel mobility shift assay for MerR with its promoter DNA (5-atcgcttgactccgtacatgagtacggaagtaagg-3, 50 nM). Lanes 1-5, MerR bindi

34、ng to DNA; lanes 6-10, binding of Hg2+ to MerR did not give a noticeable change of MerRs affinity to DNA. Fluorescence anisotropy measurementsCd2+(No CadR)Zn2+(No CadR)Ni2+(No CadR)Cadmium(II)-binding induces dissociation of CadR from DNA.Phage Display Selection Scheme抗体-CadRDNA复合物晶体抗体-CdCadR复合物晶体Me

35、talloprotein EngineeringEngineering A Uranyl-Specific Binding Protein from NikRSeraphine V. Wegner, Hande Boyaci, Hao Chen, Mark P. Jensen, Chuan He, Angew. Chem. Intl. Ed. 2009, 48, 2339 2341绿脓杆菌金黄色葡萄球菌MexAB-OprMMexAB-OprM泵泵MexCD-OprJMexCD-OprJ泵泵MexEF-OprNMexEF-OprN泵泵MexXY-OprMMexXY-OprM泵泵细菌多药耐药性调控细菌多药耐药性调控四环素、四环素、-内酰胺、内酰胺、氯霉素、新生霉素、氯霉素、新生霉素、大环内脂类、磺胺类大环内脂类、磺胺类药物、甲氧苄氨嘧啶药物、甲氧苄氨嘧啶绿脓杆菌绿脓杆菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌PNAS,Vol.105,2008,NO.36 PNAS,Vol.105,2008,NO.39MexRMexR 蛋白晶体结构与一级结构蛋白晶体结构与一级结构MexRMexR蛋白氧化后二硫键的形成蛋白氧化后二硫键的形成Hao Chen*, Chengqi Yi, Jin