免疫沉淀类试验——免疫比浊

1、沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在适与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现当条件下发生特异性结合所出现的的沉淀现象沉淀现象。分类分类液体内沉淀试验液体内沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定免疫浊度测定凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫扩散免疫电泳免疫电泳单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应沉淀反应免疫浊度测定免疫浊度测定概念：将现代光学测量仪器与自动化分析概念：将现代光学测量仪器与自动化分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，可以检测系

2、统相结合应用于沉淀反应，可以对各种液体介质中的微量抗原、抗体和对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。测定。（一）免疫浊度分析的基本原理： 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物小分子免疫复合物(19S)，使反应液出现浊度。，使反应液出现浊度。在在抗体稍微过量且固定的情况下抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶

3、液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量标本中抗原的含量（二）类型u 透射免疫比浊法u 通过检测光被吸收、衍射、反射和折射通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物后光线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。u 2、散射免疫比浊法u 通过检测光折射和衍射而形成的散射光通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。强度来定量抗原抗体的复合物。u 3、免疫胶乳比浊法u 以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进以胶乳作为载

4、体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度灵敏度。 1 透射免疫比浊法原理：原理： 可溶性抗原抗体在一定缓冲液中发生反可溶性抗原抗体在一定缓冲液中发生反应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应的溶液时，被其中的免光线通过抗原抗体反应的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量保持抗体过量的情况下，的情况下，免疫复合物量越多，透射光越少，光线被吸收免疫复合物量越多，透射光越少，光线被吸收越多，用吸光度来表示。即吸光度与免疫复合越多，用吸光度来表

5、示。即吸光度与免疫复合物量物量呈正相关呈正相关。可用抗原标准品建立标准曲线，。可用抗原标准品建立标准曲线，测出待检抗原含量。测出待检抗原含量。 由于免疫复合物颗粒大小再由于免疫复合物颗粒大小再35-100nm，对近紫外的光线可见最大，对近紫外的光线可见最大吸收峰，故选择吸收峰，故选择290-410nm波长测波长测定最佳，目前多用定最佳，目前多用340nm方法评价：优点：优点： 灵敏度比单扩法高灵敏度比单扩法高510倍；倍； 操作简便快速，操作简便快速，1h可报可报告结果；告结果；结果准确，且能用全自动结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳行分析，尤其

6、随着胶乳粒子增强浊度测定法的粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。其应用更加广泛。缺点：缺点：u抗体用量较大；抗体用量较大；u检测需抗原抗体反应检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；达到平衡，耗时较长；u溶液中存在的抗原抗溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够体复合物分子应足够大。大。灵敏度较散射比浊法灵敏度较散射比浊法低。低。2 散射免疫比浊法原理：原理： 散射光散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到溶液中的免疫复合物，对光线产生反射和碰到溶液中的免疫复合物，对光线产生反射和折射而形成的。散射浊度法是在入射光的一定折射而形成

7、的。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与散射光的强度与复合物的含量呈正比，复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率速率散射比浊法散射比浊法(rate nephelometry)(rate nephelometry)和和终点散射比终点散射比浊法浊法(endpoint nephelometry)(endpoint nephelometry)。3 免疫胶乳比浊法原理原理 是一种带载体的免疫比浊法，用抗体致敏的大是一种带载体的免疫比浊法，用抗体致敏的大

8、小适中，均匀一致的胶乳颗粒（一般是小适中，均匀一致的胶乳颗粒（一般是0.2m0.2m），），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上抗体与抗原特异在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上抗体与抗原特异性结合，引起胶乳颗粒凝集。分散的单个胶乳颗性结合，引起胶乳颗粒凝集。分散的单个胶乳颗粒直径位于入射光波长之内，光线可透过，当粒直径位于入射光波长之内，光线可透过，当2 2个个或或2 2个以上胶乳凝集时，则使透过光减弱或散射光个以上胶乳凝集时，则使透过光减弱或散射光增强。这种减少或增强的程度与胶乳凝集成正比，增强。这种减少或增强的程度与胶乳凝集成正比，与抗原浓度呈正相关。与抗原浓度呈正相关。（a a）带抗体的胶乳在波长之内

9、可透过光线；）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b b）结合后，则形成光线衰减）结合后，则形成光线衰减方法评价1 1、敏感度高，可达到、敏感度高，可达到ng/Lng/L水平水平2 2、操作简单，容易自动化、操作简单，容易自动化3 3、结果稳定、可靠，特异性好；不需、结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。用。 (三)、主要影响因素u抗原抗体比例抗原抗体比例u抗体的质量抗体的质量u抗原抗体反应的溶液抗原抗体反应的溶液u增浊剂的使用增浊剂的使用1 抗原抗体比例u 高剂量钩状效

10、应（高剂量钩状效应（high dose hook high dose hook effect )effect )u 海德堡（海德堡（heidelbergerheidelberger）曲线理论）曲线理论u 2 抗体的质量（1 1）特异性高）特异性高（2 2）效价高）效价高（3 3）亲和力高）亲和力高（4 4）抗血清来源）抗血清来源3 抗原抗体反应的溶液 pH 6.58.5 电解质电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）4 增浊剂的使用 PEGPEG、tween-20tween-20等非离子型亲水剂等非离子型亲水剂 作用：消除蛋白质分子周围的电子作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子云和水化