沈阳地区各型丙型肝炎患者丙型肝炎病毒的基因分型

1、    沈阳地区各型丙型肝炎患者丙型 肝炎病毒的基因分型        【摘要】目的研究沈阳地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布状况及其临床意义。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法对沈阳地区84例血清抗-HCV及HCV RNA均阳性的各临床型丙型肝炎患者进行HCV基因分型。结果84例丙型肝炎中，HCV-型45例(53.6%)，HCV-型26例(30.9%)，/混合型13例(15.5%)；HCV不同基因型在各型丙型肝炎中总体分布不一致，经统计学处理，P<0.05

2、；在急性肝炎、慢性肝炎轻度、中度、重度及肝炎后肝硬化中，HCV-型感染分别占55.6%，36.2%，75.0%，85.7%及88.9%；HCV-型感染分别占22.2%，46.8%，8.3%，0%骸11.1%。结论沈阳地区HCV感染以型为主，其次为型及/混合型；HCV基因型与丙型肝炎严重程度密切相关。【主题词】丙型肝炎丙型肝炎病毒基因，病毒Study on HCV genotypes in different clinical types of hepatitis C patients in Shenyang areaHUANG Fen, CAI Cuifang, ZHAO Guizhen, e

3、t al. Department of Infectious Diseases, The Second Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang, 110003【Abstract】ObjectiveTo study the distribution of HCV genotypes in different clinical types of hepatitis C in Shenyang area and its clinical significance.MethodsThe HCV genotypes of 84

4、HC patients of different clinical types were detected by PCR assay with four kinds of type-specific primers.ResultsIn 84 patients with hepatitis C, the HCV- and HCV- genotypes and the / mixed genotype were 53.6%,30.9% and 15.5% respectively. The distribution of HCV genotypes in different HC clinical

5、 types was not identical, P<0.05. In acute hepatitis, in mild, moderate and severe degree of chronic hepatitis, and in liver cirrhosis, the infection rates of genotype HCV were 55.6%,36.2%,75.0%,85.7% and 88.9% respectively, but that of genotype were 22.2%,46.8%,8.3%,0% and 11.1% respectively.Con

6、clusionInfection of geno type HCV was predominant in Shenyang area followed by HCV- and / mixed geuotypes. The different genotypes of HCV were related to the severity of hepatitis C.【Key words】Hepatitis C virusGene, viral近年来发现丙型肝炎病毒(HCV)变异较大，存在多种基因型。目前证实HCV至少存在12个基因型，广泛分布的有/1a、/1b、/2a、/2b和/3a型。HCV不同

7、基因型与HCV基因型进行深入研究具有其实用价值。我们用PCR法对沈阳地区84例各型丙型肝炎进行HCV基因分型研究，旨在了解本地区HCV基因型分布状况。1材料和方法1.1研究对象84例血清抗-HCV及HCV RNA均阳性的各型丙型肝炎病人均为1993年7月1996年6月本院传染科门诊及病房就诊及住院患者。包括急性肝炎9例，慢性肝炎66例(轻度47例，中度12例，重度7例)，肝炎后肝硬化(均为活动性)9例。其中男性69例、女性15例，平均年龄38.8±15.6岁，有输血或血制品史者43例(51.2%)，排除重叠或混合感染乙型肝炎者。诊断均符合1990年上海第六届全国病毒性肝炎会议制定的诊

8、断标准，并参照1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准。其中2例肝硬化经手术病理证实。1.2HCV引物及主要试剂1.2.1HCV引物HCV Core基因区分型PCR引物由中国科学院上海生物工程研究中心合成。型共同性引物：P1正链5-CGCGCGACTAGGAAGACTTA-3(nt 139158)(从core基因启始密码子第一个核苷酸算起)，P2负链5-ATGTACCCCATGAGGTCGCT-3(nt 391410)。型特异性引物：P3正链5-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3(nt 148167)，P4负链5-TGCCTTGGGGATAGGCTGAC-3(

9、nt 185204)(HCV-)；P5负链5-GAGCCATCCTGCCCACCCCA-3(nt 272291)(HCV-)；P6负链5-CCAAGAGGGACGGGAACCTC-3(nt 302321)(HCV-)；P7负链5-ACCCTCGTTTCCGTACAGAG-3(nt 251270)(HCV-)。1.2.2主要试剂：逆转录酶(AMV-RT)、Tag酶、RNA酶抑制剂(RNasin)均为Promega公司产品。1.3血清RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法提取血清总RNA。1.4HCV基因分型参照OKamoto1引物特异PCR法并加以改进。逆转录及第1次PCR扩增：扩增体积30 l，其中

10、已提取的PNA中加入AMV-RT5 U，RNasin 20 U，Taq酶2 U，2 mmol/L dNTP 3 l，10×AMV-RT缓冲液3 l，型共同性引物P1及P2终浓度分别为0.8 mol/L。42逆转录20 min后接第1次扩增，反应条件为9460 s, 5590 s,72120 s，共35个循环。第二次PCR扩增：总体积30 l，其中第1次PCR扩增产物5 l加入10×AMV-RT缓冲液3 l，2 mmol/LdNTP3 l，Taq酶2 U，型特异性引物P3P7终浓度均为0.8 mol/L，反应条件为9460 s，6060 s，7290 s，共30个循环，72延

11、伸5 min。每次扩增均设HCV RNA阳性血清对照，未加模板的阴性对照。第2次PCR扩增产物10 l在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，HCV、型的扩增产物长度分别为57 bp, 144 bp, 174 bp及123 bp。2结果2.184例血清抗-HCV及HCV RNA均阳性的丙型肝炎HCV基因分型结果84例丙型肝炎中，HCV-型45例(53.6%)，HCV-型26例(30.9%)，/混合型13例(15.5%)。未检出型及型。见1。     <"65-1 (13141 bytes)" src="

12、;/med/cano/201003/20100319181848412" 260 243>1丙型肝炎HCV基因分型结果1：?174 DNA/Hae ；2，6：HCV-型；3：HCV-型；4，5：/混合型；7：阴性对照Fig.1The results of HCV genotyping1:?174 DNA/Hae marker. 2,6:HCV- genotype.3:HCV- genotype.4,5: / mixed type. 7: Negative control2.2各型丙型肝炎HCV基因分型结果各型丙型肝炎HCV基因分型结果表明，HCV不同基因型在不同临床类型丙型肝炎

13、中总体分布不一致，经RXC表2检验，2=18.2,P<0.05。在急性肝炎、慢性肝炎轻度、中度、重度及肝炎后肝硬化中，HCV-型感染分别占55.6%，36.2%，75.0%，85.7%及88.9%；HCV-型感染分别占22.2%，46.8%，8.3%，0%及11.1%。慢性肝炎中度、重度及肝炎后肝硬化组HCV-型感染率显著高于慢性肝炎轻度组(P<0.05或P<0.01)；HCV-感染率显著低于慢性肝炎轻度组(P<0.05)。见表1。表1各临床型丙型肝炎HCV基因分型结果Tab.1HCV Genotypes of hepatitis C in different clin

14、ical typesHC临床类型HC clinical types例数Cases型Genotype型Genotype/混合型型/mixed type例数Cases(%)例数Cases(%)例数Cases(%)急性肝炎Acute hepatitis95(55.6)2(22.2)2(22.2)慢性肝炎Chronic hepatitis轻度Mild degree4717(36.2)22(46.8)8(17.0)中度Moderate degree129(75.0)*1(8.3)*2(16.7)重度Severe degree76(85.7)*1(14.3)肝硬化Liver cirrhosis98(88.

15、9)*1(11.1)*合计Total8445(53.6)26(30.9)13(15.5)     注：与慢性肝炎轻度比较，经2检验，*P<0.05，*P<0.01Note:Compared with mild degree of chronic hepatitis, by 2test,*P<0.05，*P<0.012.3输血后丙型肝炎及散发性丙型肝炎患者HCV的基因分型结果输血后及散发性丙型肝炎患者HCV基因分型结果表明，HCV不同基因型在输血后丙型肝炎及散发性丙型肝炎中分布一致，经R×C表2检验，2=2.05，P>

16、;0.05。见表2。表2输血后及散发性丙型肝炎HCV基因分型结果Tab.2HCV genotypes of post-transfusion and sporadic hepatitis CHC组别HC Group例数Cases型Genotype型Genotype/混合型/mixed type例数Cases(%)例数Cases(%)例数Cases(%)输血后肝炎Post-transfusion hepatitis4322(51.2)12(27.9)9(20.9)散发性肝炎Sporadic hepatitis4123(56.1)14(34.1)4(9.8)   &#

17、160; 3讨论HCV基因型有一定的地区分布，美国以型为主，日本以型为主，我国也以型为主，其次为型。杜绍财等2报道北京、武汉、广州、西安、重庆、广西等地区HCV感染均以型为主，这些地区中北京型感染率最高(19%)，广州/混合型感染率最高(9%)。本研究结果表明沈阳地区HCV感染以型为主(53.6%)，其次为型(30.9%)，/混合型亦不少见(15.5%)，提示本地区型及/混合型感染较其它地区高，因此今后本地区HCV感染的病原学诊断、临床治疗、疫苗研制等研究，除应着重针对型病毒进行外，不应忽视型及/混合型。Pistello等3通过肝组织学检查及HCV基因型研究，指出HCV-型与严重肝损害有关。P

18、ozzato等4报道伴有肝硬变的患者均为HCV-型感染，而无肝硬变的慢性肝炎则分布在其他三个类型或混合型中，认为HCV基因型与慢性肝病的严重程度有关。本研究结果表明，HCV不同基因型在不同临床类型丙型肝炎中总体分布有显著差异(P<0.05)。急性肝炎、慢性肝炎中度及重度、肝炎后肝硬化组HCV感染以型为主，且HCV-型感染率，肝硬化组>慢性肝炎重度>慢性肝炎中度>急性肝炎；而谷丙转氨酶轻度升高或正常的慢性肝炎轻度患者HCV感染以型为主。提示HCV-型可能具有较强的毒力及致病性，因此HCV-型感染所致丙型肝炎较重，而HCV-型感染所致丙型肝炎临床病情多较轻，HCV基因型与丙型肝炎病人临床病情及其严重程度密切相关。HCV基因型在输血后丙型肝炎与散发性丙型肝炎中分布无显著差异，说明HCV感染型别与感染途径无密切关系。本研究中，散发性丙型肝炎中慢性肝炎轻度偏多，临床病情略轻于输血后丙型肝炎，但经统计学处理无显著差异，该组HCV-型感染(34.1%)略高于输血后丙型肝炎(27.9%)可能与此有关。输血后丙型肝炎/混合型感染(20.9%)高于散发性丙型肝炎(9.8%)，提示/混合型感染可能与反复输血及血制品有关。本课题属辽宁省科研基金资助项目作者单位：110003沈阳 中国医