第2章DNA重组(3DNA片段的连接重组)

1、第二章 DNA重组 自学为主4 DNA的化学合成的化学合成与与DNA的凝胶电泳的凝胶电泳5 DNA片段的连接重组片段的连接重组5.1 DNA连接酶的发现连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。 这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用

2、ATP腺苷三磷酸作能源。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的并不能够连接两条单链的DNA分子或环分子或环化的单链化的单链DNA分子分子，被连接的链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋封闭双螺旋DNA骨架上的切口骨架上的切口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。5.2 DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质 修复双链修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键上切口处的磷酸二酯键5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33C-G-AG A-C-G-T-C-C-T-C 5OH PP OH5G-C-T-C-T-G-C-A-G-

3、G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknickDNA连接酶连接酶 修复与修复与RNA链结合的链结合的DNA链上切口处的磷链上切口处的磷酸二酯键酸二酯键5G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G- A-C-G-T-C-C-T-C 5P OHDNA连接酶连接酶nick 连接多个平头双链连接多个平头双链DNA分子分子5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5P-C-A-G-G

4、-A-G 3OH-G-T-C-C-T-C 5DNA连接酶连接酶5G-C-T-C-T-G-OH3C-G-A-G-A-C-P5.3 分类分类DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶来源来源大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体能源辅助因子能源辅助因子 NAD+ATP功能功能催化催化DNA粘性末端粘性末端的连接的连接粘性末端、平末粘性末端、平末端均可连接端均可连接10连接缓冲液连接缓冲液 1.0L目的序列回收产目的序列回收产物物5.0LT4 DNA连接酶连接酶（3U/ L）0.5L双酶切后的植物双酶切后的植物表达载体表达载体3.5L总体积总体积10.0L 1U DNA连接酶的酶活连接酶的酶活性：在最佳反应

5、条件下性：在最佳反应条件下15 反应反应1 小时小时，完全，完全连接连接1g-DNA（HindIII片段）所需的片段）所需的酶量酶量5.4 DNA连接酶的反应体系连接酶的反应体系某植物表达载体的连接体系某植物表达载体的连接体系 连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为415比较合适。 平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在较高的温度进行，如22 。 同种内切酶产生的粘性末端的连接 同尾酶产生的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接5.5 体外连接体外连接DNA片段的方式

6、片段的方式粘粘性性末末端端 平末端的直接连接 末端修饰后的连接 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接 DNA接头(adapter)连接法具粘性末端的具粘性末端的DNA片段的连接比较容易片段的连接比较容易，也较常用。，也较常用。5.5.1同种内切酶产生的粘性末端的连接同种内切酶产生的粘性末端的连接GAATTCCTTAAG55GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG55EcoRI GCTTAA55AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG5AATTCGGCTTAA5T4DNA连接酶连接酶退火退火GCTTAAGCTTAA5AATTCG5AA

7、TTCG5.5.2同尾酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接TGATCAACTAGT55GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55BclI BamHITACTAG55GATCATGCCTAGGATCCGT4DNA连接酶连接酶退火退火GCCTAGGATCCG5GATCATTACTAG5GCCTAGGATCCG5GATCATGCTTAA55.5.3不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接CTGCAGGACGTC55GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG55BamHIPstI CTGCAG55GACGTCGCCTAGGATCCGT4-DNA pol切平切平Klenow补平补

8、平CG55GCGGATCCCTAGGATCCCTAGGT4DNA ligaseGCCTAGGATCCG5GATCGCCGCTAG5GCCTAGGATCCG5GATCGCCGCTAG55.5.4平末端的直接连接平末端的直接连接 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM5

9、.5.4平末端的直接连接平末端的直接连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。直接用直接用T4DNA连接酶连接平末端连接酶连接平末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5P-C-A-G-G-A-G 3OH-G-T-C-C-T-C 5DNA连接酶连接酶5G-C-T-C-T-G-OH3C-G-A-G-A-C-P5.5.5末端修饰后的连接末端修饰后的连接 DNA片段末端同聚物加尾同聚物加尾后连

10、接（用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来） 粘性末端修饰成平末端粘性末端修饰成平末端后再连接DNA片段末端同聚物加尾后连接片段末端同聚物加尾后连接3突出末端突出末端GCATG3 C55C3GTACGTdTdCTPTdTdGTPGCATGCCCCCC3 C55C3CCCCCCGTACG退火退火 KlenowT4DNA ligasePstISphICTGCA 3GG3 ACGTC55CTGCAGGGGGG 3GG3 GGGGGGACGTC55CTGCAGGGGG

11、GGGGGGGGGACGTC55GCATGCCCCCC C55CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGGGGGGGGACGTC55GCATGCCCCCC C55CCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC CGTAC55CATGCCCCCCCGTACGCTGCAGGGGGGGACGTTGCAGGGGGGGACGTCGCATGCCCCCC CGTAC55CATGCCCCCCCGTACGPstI酶切位点酶切位点粘性末端修饰成平末端后再连接粘性末端修饰成平末端后再连接GCTTAA55AATTCGEcoRIBamHIGAATTC

12、TTAA55AATTCTTAAGKlenow补平补平Klenow补平补平GAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGTdTdGTPGCCTAGGATCCG55GGATCCCTAGGATCCCTAGG55GGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGG55TdTdCTPT4DNA ligaseGAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGCTTAA55AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGBa

13、mHI酶酶切位点切位点5突出末端突出末端5.5.6加上连杆后再连接加上连杆后再连接 如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。 所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。 DNA片段末端加上化学合成的连杆或接头，能形成粘性末端，连接后可用内切酶进行切割。 连杆的5-末端和待克隆的DNA片段5-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连

14、接起来。接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来 DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的连杆，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。 5.5.7DNA接头(adapter)连接法 于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。小结：平末端小结：平末端DNA片段的连接片段的连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。 基因工程中