二重逆转录-聚合酶链反应及微孔板反向杂交法检测丙型与庚型肝炎

1、    二重逆转录-聚合酶链反应及微孔板反向杂交法检测丙型与庚型肝炎病毒        【摘要】目的为适应临床上需同时检测庚型肝炎病毒(HGV)与丙型肝炎病毒(HCV)感染情况，建立了二重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及微孔板反向杂交法。方法根据HCV与HGV基因高度保守区自行设计引物，建立了用二重RT-PCR同时检测HCV与HGV RNA方法，并分别用HCV与HGV特异探针微孔板反向杂交检测PCR产物。结果PCR产物经测序，HCV与Takamizawa等及Choo等报

2、道的核苷酸同源性分别为93.1%94.1%与92.5%93.7%，HGV与Simons等、Linnen等及常锦红等的核苷酸同源性分别为90.7%92.5%、92.0%92.1%与94.3%94.5%。测定敏感度约是单式扩增电泳法的100倍，20次重复测定HCV与HGV的CV值分别为8.9%与9.8%。微孔板杂交NaOH最佳终浓度为0.10.15mol/L,最佳杂交时间为3050分钟。137例血清样本检测表明，在肝炎患者与血透患者HCV单独阳性为13.9%，HGV为5.1%，HCV与HGV同时阳性为5.8%。结论本文用微孔板杂交酶呈色技术检测HCV与HGV二重RT-PCR产物敏感、特异、快速，重

3、复性良好，无溴乙锭污染，经适当改良可用于半定量测定，有较好推广价值。【主题词】肝炎/病毒学丙型肝炎病毒庚型肝炎病毒聚合酶链反应Detection of hepatitis C virus and hepatitis G virus RNA by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction and microtiter plate reverse hybridization Wang Huimin,Zhang Donglei,Xu Fanqin,et al.Affiliated Hospital of Nantong Med

4、ical College,226001AbstractMultiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for the simultaneous detection of HCV and HGV RNA has been established,in which primers were deduced from high conservative region of HCV and HGV and PCR amplicons were detected by microtiter plate reverse hybridiza

5、tion with HCV or HGV specific probe.Sequence analyses showed that amplicons of HCV were 93.1%94.1% and 92.5%93.7% of nucleotide homology compared with Takamizawa and Choo,and amplicons of HGV were 90.7%92.5%、92.0%92.1% and 94.3%94.5% of nucleotide homology with Simons,Linnen and Chang.The detective

6、sensitivity was 100 times over that of electrophoretic assay with single amplification.CVs of HCV and HGV were 8.9% and 9.8%,respectively,and the optimal concentration of NaOH for hybridization was 0.10.15mol/L.The optimal time for hybridization was 3050minutes.The results of detection with multiple

7、x PCR showed the presence of infection with HCV or HGV alone and coinfection with both % them.Key words:Hepatitis/VirologyHepatitis C virusHepatitis G virus.Polymerase chain reaction庚型肝炎病毒(HGV或GBV-C)是一种非肠道传播的病毒，自1995年Simons等1及1996年Linnen 等2相继报道HGV全基因序列以来，尽管对HGV是否真正属肝炎病毒尚有争议，但国内外均报道在肝炎人群有较高的感染率。HGV与丙

8、型肝炎病毒(HCV)同属黄病毒属，病毒结构十分相似，具相似的传播途径，临床上常需同时了解HGV与HCV的感染情况3，为此我们建立了用二重RT-PCR同时检测HGV与HCV RNA方法，对PCR产物分别用HCV或HGV特异探针与之进行反向杂交，再进行酶呈色，该法经临床近一年的应用效果良好。1材料和方法1.1样本来源全部样本均来自本院传染科住院患者与肾病血透患者，抽血后于一小时内分离血清，-30冻存备用。1.2试剂dNTP与AMV逆转录酶为美国Promega公司产品，硫氰酸胍购自德国Serva公司，Rnasin、Taq酶与酶标亲和素购自华美公司，杂交微孔板由上海浩源公司提供。1.3引物合成根据Ta

9、kamizawa等4与Choo等5报告的基因序列在5'NCR设计HCV引物与探针。意义链5'Biotin GCAGAAAGCGTCTAGCCAT，反意义链5'BiotinCTCGCAAGCACCCTATCAGGCA,探针5'GGAGAGCCATAGTGGTCTGCG.根据Simons等1与Linnen等2报道的HGV基因序列在NS5b区设计引物与探针，意义链5'BiotinTGAGGAGGCAATAAGGA-CTG，反意义链5'BiotinGTGTACTGGAAGGCGTAAG-C,探针5'TGGGCTGGGGATCTAAGGTGTC。引

10、物由中科院上海细胞生物所合成，探针由上海浩源公司合成。1.4RNA抽提与cDNA合成同文献6。1.5PCR取6l cDNA液加入50l PCR反应液中，其终浓度为1×Taq酶buffer,220mol/L dNTP,0.1g/L明胶，2.0mmol/L MgCl2,HCV与HGV引物各为0.32mol/L,2U Taq酶。94变性3分钟后，9450秒、5250秒、7270秒，35次循环(PE9600扩增仪)。1.6预杂交在扩增结束前约1小时分别取25l HCV与HGV探针液(50mol/L)与25l 0.25mol/L NaOH混匀，取2排微孔板于一排中加入25l HCV探针混合液，

11、另一排加同样量HGV探针混合液，各加100l杂交液(0.25g/L Ficoll400,0.25g/L BSA,0.25g/L PVP,0.0625g/L牛DNA，每升含20×SSC312.5ml,1.0mol/L HCl 375ml)，混匀后3740分钟，弃微孔板中液体，倒置于干净吸水纸上使干。1.7杂交与呈色扩增结束后于每个PCR反应管中加入50l0.25mol/L NaOH并混匀，分别取25l加入已预杂交的HCV与HGV微孔板内，再加入100l杂交液，3740分钟，用pH7.4PBS洗涤3次，拍干。加入酶标亲和素应用液100l，3715分钟，洗板后加入TMB显色液100l,37

12、10分钟，加入100l 2mol/L H2SO4,于酶标仪450nm比色。2结果2.1扩增产物电泳结果经二重PCR扩增后，HCV产物为244bp，HGV产物为315bp，二者在2%琼脂糖电泳上可完全分离，电泳结果见1。DNA Marker分子量分别为237、377、515、695、994与1543bp。<"32 (37722 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180121230" 172 227>1二重RT-PCR同时检测HCV与HGV RNA电泳1：阴性血清；2：DNA marker；3：HCV与H

13、GV同时阳性血清；4：HGV阳性血清；5：HCV阳性血清Fig.1Electrophoresis of multiplex RT-PCR products of HCV and HGV RNA 1:Negative sample. 2:DNA marker. 3:HCV and HGV both positive sample. 4:HGV positive sample. 5:HCV positive sample2.2扩增产物核苷酸序列分析用不含Biotin的同样序列的引物进行二重PCR扩增，任意取单独HCV或单独HGV阳性的PCR产物各二份，进行正负链双向核苷酸序列测定(由中科院上海植物

14、生理研究所完成)，不同方向测序结果100%相符。HCV序列与Takamizawa等4及Choo等5报道的核苷酸同源性分别为93.1%94.1%与92.5%93.7%。HGV序列与Simons等1、Lennin等2及常锦红等(HG-C1株)7的核苷酸同源性分别为90.7%92.5%、92.0%92.1%与94.3%94.5%。2.3与电泳法测定敏感度比较取HCV与HGV同时阳性血清，用正常混合血清1：10系列稀释，分别用微孔板杂交法与电泳法检测PCR产物，电泳检测法的PCR扩增又分为单式与套式扩增，套式扩增方法见文献6，检测 表1不同方法检测敏感度比较Tab.1Different methods

15、 to compare sensitivity单式扩增，微孔板杂交法单式扩增，电泳法检测产物套式扩增，电泳法检测产物血清稀释Single amplification,Single amplification,Nested amplification,Serum dilutionMicrotiter hybridizationElectrophoresisElectrophoresisHCVHGVHCVHGVHCVHGV10-1+10-2+-+10-3+-+-10-4+-10-5-     敏感度如表1。2.4重复性测定取HCV与HGV同时阳性血清重复测定

16、20次，HCV与HGV吸光度值的<"x- (914 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180121382" 15 21>±s分别为0.164±0.0146与0.134±0.0131，CV分别为8.9%与9.8%。2.5NaOH对PCR产物变性影响在PCR产物中加入等量不同浓度NaOH,NaOH终浓度为0.050.40mol/L,结果见2。<"33 (3693 bytes)" src="/med/cano/201003/201003191

17、80121793" 275 154>2不同浓度NaOH对产物变性作用的影响Fig.2Effect on denaturation with different NaOH concentrations2.6杂交时间的影响取单独HCV阳性PCR产物与探针的杂交时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80分钟，结果在3050分钟有一较为平坦的峰值。2.7临床样本检测用新建立的二重RT-PCR微孔板反向杂交法共检测各型肝炎及血透患者血清137例，结果见表2。3讨论用二重RT-PCR可在同一反应体系中测定HCV与HGV RNA，与分别单独检测HCV或HGV RNA相比，可减轻

18、操作人员的工作强度，降低检测成本。作者曾应用套式PCR、电泳法进行二重RT-PCR检测6，该法需二次扩增，测定时间较长，且在第二次扩增时易造成交叉污染。本文采用的单式扩增、微孔板反向杂交酶呈色技术不但可以克服以上缺点，探针杂交既可提高特异性，由于偶联酶对信号的放大作用，还可提高检测敏感度。文献常用的杂交法为正向杂交，即将PCR产物固定于微孔板上再进行杂交，方法十分繁杂。本法所用的反向杂交可将探针在PCR扩增结束前预先结合于微孔板上，探针与微孔板结合后至少可稳定一个月，与常用的套式PCR法或正向杂交法相比，整个操作过程至少可缩短2小时。HCV基因在5'NCR有较好的保守性，大多数作者亦认

19、为HGV同样在5'NCR较为保守，而我们曾证实HGV基因的NS5b区较保守性更好8，对HCV与HGV阳性各二例的扩增产物测序结果表明，与国内外报道的核苷酸同源性均大于90%，PCR产物经电泳亦未发现明显的引物多聚体及非特异区带(1)。 表2137例临床样本微孔板反向杂交检测结果Tab.2Detective results of 137clinical samples with microtiter plate reverse hybridization分组检测例数HCV阳性(%)HGV阳性(%)HCV+HGV阳性(%)GroupCases testedHCV positive(%)HG

20、V positive(%)HCV+HGV positive(%)急性肝炎Acute hepatitis373(8.1)2(5.4)1(2.7)慢性迁延性肝炎Chronic persistent hepatitis212(9.5)3(14.3)1(4.8)慢性活动性肝炎Chronic active hepatitis417(17.1)1(2.4)3(7.3)肝硬化Cirrhosis264(15.4)1(3.8)1(3.8)重症肝炎severe hepatitis41(25.0)血液透析Hemodialysis82(25.0)2(25.0)合计Total13719(13.9)7(5.1)8(5.8

21、)     NaOH浓度及杂交时间对杂交反应影响较大，低浓度NaOH时DNA解链不完全，高浓度时可导致DNA损伤，终浓度以0.10.15mol/L为宜。杂交时间可影响杂交效率，小于15分钟时稳定性较差，以40分钟为好。本法检测敏感度约是单式扩增电泳法的100倍(表1)，亦优于套式扩增电泳法，有良好的批内重复性，HCV与HGV CV值均10%，在137例各型肝炎患者与血透患者中，可检出单独HCV或HGV阳性及二者同时阳性病例，有关详细临床资料将另文报告。本文结果表明，用微孔板杂交酶呈色技术检测HCV与HGV二重RT-PCR产物敏感、特异、快速，重复性良好，无溴乙锭污染，经适当改良可用于半定量测定，有较好的推广应用价值。参考文献1Simons J N,Leary T P,Dawson G T,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995，1:564-569.2Linnen J,Wages J,Zhang keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a tran