纤维素酶活力的测定

1、纤维素酶活力的测定纤维素酶活力的测定1. 目的和内容目的和内容 目的：目的：了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握 其活力的测定方法。其活力的测定方法。 内容：内容：测定并计算纤维素酶的活力。测定并计算纤维素酶的活力。2. 基本原理基本原理 2.1. 纤维素酶是一类分解纤维素的纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶复合酶，目前公认的有，目前公认的有四种四种:（1）内切）内切-1,4-葡聚糖酶；（葡聚糖酶；（2）外切）外切-1,4-葡聚糖酶；葡聚糖酶；（3）纤维二糖水解酶；）纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（）纤维二糖酶（-葡聚糖苷酶）。葡聚糖苷酶）。纤维素酶液中各种酶的

2、作用方式图纤维素酶液中各种酶的作用方式图 2.2 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNS）还原，生成还原，生成红棕色的氨基化合物，在红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 由不同底物测得的酶活力分别称作由不同底物测得的酶活

3、力分别称作FPA (滤纸糖酶活力滤纸糖酶活力) 和和CMCA (羧甲基纤维素酶活力羧甲基纤维素酶活力)。DNSDNS与还原糖的反应与还原糖的反应540nm滤纸葡萄糖氨基化合物(红棕色)纤维素酶测定吸光值DNS试剂50,1h沸水浴10min 为了统一标准，目前通常用中华人民共和国轻工行业标为了统一标准，目前通常用中华人民共和国轻工行业标 准准QB 2 5 8 3 一一2 0 0 3，以滤纸作为纤维素酶作用的底物。，以滤纸作为纤维素酶作用的底物。 纤维素酶水解纤维素酶水解滤纸滤纸释放的释放的还原糖还原糖，与碱性条件下的，与碱性条件下的DNS试试剂发生反应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在剂发生反

4、应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在540nm下下有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关系来计算纤维素酶的活力（系来计算纤维素酶的活力（FPA）。）。2.3 滤纸酶活力滤纸酶活力 Filter paper activity(FPA) v l g 固体酶( 或1mL 液体酶) ，在( ( 50 ,指定pH条件下( 酸性 纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶p H 6 . 0 ) , l h 水解滤纸底物，产生出相当于l m g葡萄糖的还原糖量，为1 个酶活力单位，以u / g ( 或 u / m L )表示。3.1器材：器材：水

5、浴锅、水浴锅、分光光度计、分光光度计、记时器、记时器、 比色管（比色管（4支支+6支）、支）、移液管（移液管（5支）、支）、吸耳球吸耳球3.2试剂（公用）：试剂（公用）： 如下如下 3.器材和试剂器材和试剂1 ） D N S试剂试剂 称取3 , 5 一 二硝基水杨酸( 1 0 10 . 1 ) g，置于约6 0 0 m L水中，逐渐加入氢氧化钠l o g ，在5 0 水浴中( 磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠2 0 0 g 、苯酚( 重蒸) 2 g 和无水亚硫酸钠5 g ，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至 I O O O m L ，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d 后使

6、用。2） 柠檬酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，0.05 mol/LpH4.8( 适用于酸性纤维素酶适用于酸性纤维素酶) 称取一水柠檬酸4.83 g ,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g ,用水定容至1000 mL 。调节溶液的pH到( 4.8 士0.05 ) 备用。 注:也可 采用pH 4.8乙 酸缓冲溶液: 称取三水乙酸钠8 . 1 6 g , 溶于约7 5 0 m l , 水中 ， 加入乙 酸2 . 3 1 m l , ， 用水定容至1 0 0 0 M L .调节溶液的p H到( 4 . 8 1 0 . 0 5 ) 备用3) 葡萄糖标准贮备溶液葡萄糖标准贮备溶液( 1

7、O m g / m L) 称取于( 1 0 3 士2 ) 下烘千至恒重的无水葡萄糖1 g ,精确至0.1 m g ，用水溶解并定容至1 0 0 m L ,4) 葡萄糖标准使用溶液葡萄糖标准使用溶液 分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0 . 0 0 , 1 . 0 0 , 1 . 5 0 , 2 . 0 0 , 2 . 5 0 , 3 . 0 0 , 3 . 5 0 m L于1 0 ML容量瓶中，用水定容至 1 0 m L ，盖塞，摇匀备用。 上述系列浓度应根据需要自行调整。5) 快速定性滤纸快速定性滤纸 ( 杭州新华一号滤纸) 沪1 5 c m( 每批滤纸，使用前用标准酶加以校正) 。 4.1 绘制标

8、准曲线绘制标准曲线 按表A. l 规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液 、缓冲溶液 和D NS试剂于各管中( 每管号平行作3个样) ，混匀。 将标准管同时置于沸水浴中，反应 1 0 mi n 。取出，迅速冷却至室温，用水定容至2 5 mL .盖塞，混匀。用1 0 mm比色杯，在分光光度计波长5 4 0 n n 处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标， 以吸光度为纵坐标， 绘制标准曲线， 获得线性回归方程。 线性回归系数应在0 . 9 9 9 0以上时方可使用( 否则须重做) 。 4 . 2 样样 品的测定品的测定4 . 2 . 1 待测酶液的制备 称取酶样1 g , 精确至0 . 1 m g ( 或

9、吸取液体酶样1 mL ， 精确至0 . 0 1 m L ) ， 用水（柠檬酸缓冲液，0.05 mol/LpH4.8）溶解100ml(100倍），之后分别做200倍、400倍、600倍、800倍稀释， 磁力搅拌混匀， 准确稀释定容 放置1 0 m i n ， 待测。4 . 2 . 2 滤纸条的准备 将待用滤纸放入 ( 硅胶)干燥器中平衡2 4 h : 将水分平衡后的滤纸制成宽I c m、质量为( 5 。 士。 . 5 ) m g的滤纸条，折成M型 备用。4.3 操作程序操作程序FPA酶活力按式 ( A. l )计算。XA l / 0 . 5 n 式中式中: X 样品的滤纸酶活力( ( F P A)