目基因克隆与基因文库构建

1、目基因克隆与基因文库构建从生物体基因组中分离克隆目的基因，是分子克隆技术获得应用的前从生物体基因组中分离克隆目的基因，是分子克隆技术获得应用的前提。进而，才能对目的基因进行如下研究：提。进而，才能对目的基因进行如下研究：n确定其表达调控机制和生物学功能；确定其表达调控机制和生物学功能；n建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；n将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。遗传性状，包括人体基因治疗。目的基因的

2、克隆与基因文库的构建2一般来说，目的基因的克隆策略分为两大类：n一类是利用PCR扩增、化学合成等技术体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。n另一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库另一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆。鸟枪法构建基因组文库鸟枪法构建基因组文库cDNA法构建法构建cDNA文库文库3n目的基因克隆目的基因克隆p基因分离的物理方法基因分离的物理方法p鸟枪法鸟枪法pcDNAcDNA法法pPCRPCR法法p化学合成法化学合成法n基因文库的构建基因文库的构建p鸟枪法鸟枪法pcDNAcDNA法法

3、4一、目的基因的克隆p获得目的基因，是基因工程研究中最重要的内容，也是基因工程操作中的关键。p每种基因都由四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的基因带来很大困难。p尽管如此，人们仍可通过各种方法有效地分离出所要的基因。5（一）基因分离的物理方法（一）基因分离的物理方法n根据DNA分子的两条链存在着GC，A=T碱基配对。如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，其熔解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制熔解温度使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。可以利用单链核酸酶S1，去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段 。6n用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到

4、很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000 bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E. Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出目的基因。（二）鸟枪法克隆目的基因（二）鸟枪法克隆目的基因 (Shot gun，又称霰弹法）71.鸟枪法克隆目的基因的基本策略随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的有目的基因的重组子，进而获得重组子，进而获得目的基因。目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因鸟枪法适用于原核细菌目的基因

5、的克隆分离。的克隆分离。82.鸟枪法克隆目的基因的基本步骤染色体染色体DNA的切断的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控。 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。转化受体细胞转化受体

6、细胞 筛选含有目的基因的重组子筛选含有目的基因的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 93.鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高目的重组子的出现频率。 （1）使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 10例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。（2）在连接前将DNA片段进行分级分

7、离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb11冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法（3）凝胶DNA片段回收技术 12134.鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识较难获得长度较小的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子序列优点：操作简单，命中率较高。优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会错漏目的基因。本多，可能会错漏目的基因。14（三）（三）cDNAcDNA法克隆目的基因法克隆目的基因n是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。ncDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研

8、究是极有价值的工具。ncDNA文库最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。15法克隆目的基因的基本策略mDNA（1）cDNA第一链的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs16n反转录酶：反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）（来自禽成髓细胞瘤病毒） MMLV （来自（来自 Moloey 鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）

9、 n引物：引物： Oligo（dT）和随机引物）和随机引物nOligo（dT）引导的引导的 cDNA 合成合成 是指是指 Oligo（dT）引物与引物与 mRNA 3 末端的末端的 poly（A）配对配对，引导反转录酶以，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链为模板合成第一链 cDNA 。这种这种 cDNA 合成的方法在合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于 cDNA 末端存在较长的末端存在较长的 poly（A）而影响而影响 cDNA 测序。测序。n随机引物引导的随机引物引导的 cDNA 合成合成 采用采用 610 个随机碱基的寡核

10、苷酸短片段来锚定个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的分子的 5 端序列。端序列。 随机引物随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般文库，一般用于克隆特定用于克隆特定 mRNA 的的 5 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5-RACE 。17（2）cDNA第二链的合成 煮沸NaOH自身引导法：AAAAAA

11、AAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1 nuclease18获得的双链cDNA的5端会有几对碱基缺失DNApol dNTPsRNaesH置换合成法：5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH

12、 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligaseRNaseH：催化：催化DNA-RNA杂合体的杂合体的RNA部分的核内降解，产部分的核内降解，产生不同链长、带生不同链长、带3羟基和羟基和5磷酸末端的寡核糖核酸。磷酸末端的寡核糖核酸。 19获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失dCTPTdT引导合成法：5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG

13、3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPs20获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列（3）双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段。加装人工接头引入酶切位点，以便插入片段的回收。 2122（1）完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原

14、位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。 法分离目的基因的基本程序23（2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。 24（3）差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染

15、之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 25多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆差异分离程序 26法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构。 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。仅限于克隆蛋白质编码基因。 27（四）（四）PCRPCR法克隆目的基因法克隆目的基因 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片

16、段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。法定向扩增目的基因的基本原理n定义：定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚合苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。28nPCR技术反应周期包括三个步骤：高温变性：高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分离为单链，作为模板。（91，1分钟）。低温退火：低温退火：（约50，1分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端的互补区段互补结合。适温延伸：适温延伸：将反应

17、混合物的温度上升到72，保温1分钟。2955目的基因5变性加热55引物退火55底物聚合5555加热变性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合1233031 PCR原理图原理图 32 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。 克隆目的基因的基本程序55AATT55PCR扩增产物T 载体T7lacZ MCSoriAmpr3

18、3（五）化学合成法克隆目的基因（五）化学合成法克隆目的基因u随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。u前提条件：对基因的结构序列清楚 。u分为：基因片段的全化学合成 基因的化学-酶促合成341.化学合成法的基本策略（1）全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种策略。小片段粘接法： 混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 35补丁延长法： 混合退火根据目的基因两条互补链的全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段以及20-30个碱基的单链DNA中片段T4-DNA连接

19、酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合36大片段酶促法： 混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50个碱基的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体 Klenow酶聚合37上述三种方法各有利弊：n化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；n在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。38（2）探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知。此时需

20、要从已知的氨基酸序列推测其DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的基因文库，最终获得含有目的基因的重组子。 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针。探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间。探针内部不应出现可能的互补区域。39某段连续的氨基酸序列所有可能的DNA序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T G G G T T C设计的简并探针序列TGTATGGACGAIATGAATGTATGGATGAIAT

21、GAATGCATGGACGAIATGAATGCATGGATGAIATGAA A G此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计。三个位点，八条引物三个位点，八条引物402.化学合成的单元操作n化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。n从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法。n具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。n前者操作繁琐，基本上已淘汰；n后者反应中间物的分离程序简便；nDNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的。41化学合成

22、的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂DMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基Me：甲基：甲基423.基因化学合成的优点n可以合成细菌偏爱的密码子n可以定向改变个别氨基酸n可以在两端加上需要的限制酶切点n可以通过自动化仪器合成43化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头如胰岛素基因、干扰素基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 44二、基因文库的构建451.基因文库的基本概念（1）基因库与基因文库基因库（gene

23、pool） 特定生物体基因组上所有基因的集合（天然存在）。 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部编码蛋白质的结构基因） 46（2）基因文库构建的基本策略用鸟枪法构建基因组文库：材料来自染色体DNA。所谓基因组文库是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。用cDNA法构建cDNA文库：材料来自mRNA。在高度分化的生

24、物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。47根据基因文库的功能不同把基因文库分为：n克隆文库：克隆载体n表达文库：表达载体（融合蛋白和天然蛋白表达载体），蛋白质表达文库（3）基因文库的类别48根据载体的不同把基因文库分为：n质粒文库n噬菌体文库n柯斯质粒文库n人工染色体文库不同的载体适于构建不同的文库！49（4）基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库所含最低克隆数N之间的关

25、系可用下式表示：N = ln(1P)/ln(1f)其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小/生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。50（5）基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大：以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度：避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域：以利克隆排序克隆片段易于从载体分

26、子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选51（1）基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3-5倍），经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得长达1000 kb的DNA片段。2.基因组文库的构建程序52（2）基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般

27、采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一n超声波处理：DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。n部分酶切法：一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！53（3）载体和受体的选择n基因组文库构建的载体：出于压缩重组克隆数量的原因，通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。ncDNA文库构建的载体：通常选质粒，因

28、为由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb。l-DNA 上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒10 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kbn基因文库构建的受体：根据载体使用选择大肠杆菌或酵母菌。54在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！p方法一：粘末端连接p方法二：人工接头法（4）载体与DNA片段的连接（5）转化或侵染宿主细胞在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！5556（6）从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编

29、码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。57密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆58（7）基因组文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 59（8）构建基因组文库应注意的问题n1、构建一个文库，插入、构建一个文库，插入DNA和载体

30、和载体DNA的质量是成功与否的关键。的质量是成功与否的关键。基因组基因组DNA应当非常纯以适应应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组的酶解，而且基因组DNA也应足够也应足够大（最好超过大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。）以获得两个末端的消化产物。 n2、不论是载体、不论是载体DNA还是靶还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针序列或载体的基因组少量探针序列或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。过程中它们将被鉴定为所要的克隆。 n3、部分消化产品应当是一组覆盖整

31、个基因组的随机片段。识别、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱个碱基的限制酶要比识别基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。浓度及纯度。604、在考虑把、在考虑把噬菌体臂和插

32、入噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要片段连接过程中有两个重要参数：参数：噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和的浓度和纯度。大约纯度。大约10pg噬菌臂和噬菌臂和4gDNA能产生有效地包装。对一能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于大于11066l06。 5、包装抽提物的包装效率：贮存于液氮中可保持、包装抽提物的包装效率：贮存于液氮中可保持1年多。而在年多。而在-70中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装中只能保存几星期，而且包装效率还会降

33、低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装高，且在体外包装噬菌体噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。噬菌斑。61基因组文库构建程序基因组文库构建程序n随机酶切成较大的DNA片段（10-30 Kb，平均20 Kb)，对这些片段进行分离n重组入适当载体（噬菌体）n转化进宿主菌（)，扩增，构建成基因文库n从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。（9）总结62cDNAc

34、DNA文库组建步骤如下文库组建步骤如下文库的构建程序nTotal RNA的提取的提取nmRNA的分离的分离ncDNA双链的合成双链的合成n载体的制备载体的制备n cDNA双链和载体的连接双链和载体的连接n转化或转染转化或转染n快速鉴定快速鉴定npBlueScript cDNA库扩增库扩增6364（1）利用PCR技术构建cDNA文库n能够从极其有限的起始材料中构建能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。文库。n以总以总RNA为模板合成为模板合成cDNA，无需无需mRNA的纯化，不仅简的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。n能够提高能够提

35、高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。为适用。65（2）应用差别杂交法构建cDNA文库n适用于分离经特殊处理而被诱发表达的适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆；克隆；n技术基础：技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达；一个细胞群体中目的基因不表达；n可以通过这两种总可以

36、通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进构建的克隆库进行筛选。行筛选。66差示筛选差示筛选（Differential Screening） 67（3）应用扣除杂交法构建cDNA文库n不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分的部分cDNA的集合；的集合；n用过量的参照细胞用过量的参照细胞mRNA或或cDNA与目的细胞与目的细胞cDNA或或mRNA(又称又称目的序列目的序列)杂交，形成的杂交，形成的RNA-cDNA

37、杂交体是两种细胞共有的，将杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的其扣除；剩下的cDNA或或mRNA可以标记成探针可以标记成探针(称减法或扣除探称减法或扣除探针针)，从上述目的细胞的，从上述目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆；文库中筛选目的克隆；n实质上是除去了一大批高丰度非特异性的实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表，含有的是特异表达的达的cDNA克隆及其它一些低丰度克隆及其它一些低丰度mRNA的的cDNA克隆。克隆。68扣除杂交扣除杂交（Subtractive Hybridization） 69 基因组文库 cDNA文库信息供体 DNA mRNA载体 噬菌体，黏粒

38、，人工染色体 质粒，噬菌体连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链 连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针基因组文库和cDNA文库的比较70组织组织可克隆之可克隆之DNA载体载体DNAcDNAmRNA部分酶解部分酶解DNADNA长度分级长度分级双链双链cDNADNA与载体连接与载体连接 引入宿主细胞引入宿主细胞鉴定文库的完备性鉴定文库的完备性扩增后供长扩增后供长期储存期储存筛选出所需筛选出所需要的克隆要的克隆714.基因文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基

39、因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作。72原理： n将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。n然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。n电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是

40、这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列在一起的。 （1）酶切片段末端标记法73HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体DNA克隆DNA74原理： n将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种随机序列的短探针。n用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜。n如果某两个克隆对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。 （2）随机探针联合杂交法750102030405060708091011121

41、314151617181920A B CD E FG01 02 03 04 0506 07 08 09 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20DABCEFG1111111111111111111111111111117601 04 12 06 1314 02 14 07 19 1115 05 08 16 03 10 09 20 18DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB77从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内。分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂

42、交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。 （3）染色体走读法（chromosome walking）7879n从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为筛选定克隆的过程，称为筛选.n筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆。与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆。n将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其

43、置入含放射性标记探将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标记探针溶液中保温，检出相应克隆。针溶液中保温，检出相应克隆。n通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息。蛋白质）的信息。（1）基因文库的筛选策略5.基因文库的鉴定和筛选80（2）基因文库的探针制备 寡聚核苷酸探针：寡聚核苷酸探针：DNA合成仪合成仪抗体探针：检测抗体探针：检测cDNA编码的蛋白质编码的蛋白质81寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针82抗体探针抗体探针83（3）平板杂交筛选n克隆克隆DNA转移到尼龙膜上；转移到尼龙膜上；n膜上的膜上的DNA在碱性条件下变性，在碱性条件下变性，解聚形成单链；解聚形成单链；n再通过烤膜或紫外线照射，单链再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；将与膜紧密结合；n再将膜置于含有放射性标记的核再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；其互补序列进行杂交；n杂交后充分洗去未杂交的探针，杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。然后可由放射性自显影鉴定。84对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。8586实验技术nGatewa