苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究

1、苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究         10-11-15 13:47:00     编辑：studa20                       作者：翁山耕， 胡雨云， 田雄英， 林丽娟， 林永堃【摘要】  目的 研究苦参碱对体

2、外培养的大鼠肝星状细胞系rHSC-99凋亡的影响，并探讨其机制。 方法 体外培养rHSC-99，随机分成4组：对照组(A组)，苦参碱0.12 mg/kg组(B组)，苦参碱0.24 mg/kg组(C组)，苦参碱0.48 mg/kg组(D组)。苦参碱作用24 h后，TUNEL法检测rHSC-99凋亡，半定量RT-PCR方法及免疫细胞化学方法检测rHSC-99中神经生长因子(NGF)，p75及Caspase-3的表达情况。 结果 不同浓度的苦参碱干预rHSC-99 24 h后，rHSC-99凋亡率随苦参碱的浓度增大而增高，D组凋亡率最高(P<0.01);NGF，p75，Caspase-3 mR

3、NA及其蛋白表达随苦参碱的浓度加大而表达升高，C组表达最高(P<0.01)。 结论 苦参碱可诱导HSCs凋亡。激活NGF/p75通路、上调Caspase-3蛋白表达可能是苦参碱诱导肝星状细胞凋亡的机制之一。 【关键词】  苦参碱; 星形细胞; 肝硬化; 细胞凋亡; 神经生长因子类; 神经组织蛋白质类; 基因表达肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化在此过程中起关键作用。近来研究表明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型HSC的数量，而凋亡是减少活化型HSC数量的主要途径1。已发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡

4、2。本实验观察苦参碱对体外培养的HSC凋亡的影响，并探讨其可能的机制。1 材料和方法1.1 材料 大鼠肝星状细胞系rHSC-99系保持体外培养激活的HSC特性3;苦参碱注射液(斯巴特康，广州明兴制药有限公司，10 mg/mL，每支5 mL，批号：MD2101-2);RPMI 1640培养基胰酶新生牛血清(美国Gibco公司);NGF多抗及免疫细胞组化SABC试剂盒(武汉博士德公司);逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarke(美国MBI公司);总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogin公司);原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司);引物由上海生工生物有限公司合成。1.2

5、方法1.2.1 rHSC-99细胞培养 含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液、37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至80%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按14传代。1.2.2 分组 取生长良好的rHSC-99，48孔板(免疫细胞化学法和TUNEL检测)或6孔板(RT-PCR检测)。培养24 h后再用无血清的RPMI 1640液培养24 h，随机分为：对照组(加PBS，A组);苦参碱0.12 mg/mL组(B组);苦参碱0.24 mg/mL组(C组);苦参碱0.48 mg/mL组(D组)。药物作用24 h后，分别进行形态学观察及以下各项检测。1.2.3

6、TUNEL法检测HSC的凋亡 各组均设3个复孔。按TUNEL试剂盒说明书操作。1.2.4 RT-PCR检测NGF，p75，Caspase-3的mRNA表达 0.25%胰酶消化并离心收集细胞。按Trizol法提取总RNA，逆转成cDNA。PCR反应体系25 L：10×buffer 2.5 L，2 mmol/L dNTP 2.5 L，MgCL2 1.5 L(25 mmol/L)，Cdna 2 L，Taq酶0.625 U，-actin上下游引物各0.5 L(10 pmol/L)，p75或NGF或Caspase-3上下游引物(表1)各0.5 L(10 pmol/L)，去离子水补足至25 L。

7、反应条件：95 预变性5 min，进入热循环：95 变性45 s57 退火45 s72 延伸50 s，28个循环，最后一个循环后72 继续延伸10 min。取8 L产物加溴酚兰2 L混合后经2%琼脂糖凝胶电泳，图象分析仪扫描得出峰值，半定量分析，以p75/-actin、NGF/-actin、Caspase-3/-actin作为其mRNA表达量。1.2.5 免疫细胞化学法检测NGF，p75，Caspase-3蛋白表达 各组均设3个复孔，按SABC试剂盒说明进行操作。显微镜下观察着棕黄色的为表达阳性细胞(凋亡细胞)，摄片。免疫细胞化学实验结果采用H-score法评分法分析。1.3 统计学处理 数据

8、以x±s表示，采用SPSS11.5软件系统分析，单因素方差分析检验，Kruskal-Wallis H检验比较凋亡率。福建医科大学学报 2009年11月 第43卷第6期翁山耕等：苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究表1 引物序列2 结 果2.1 形态学观察 培养的rHSC-99在苦参碱作用后细胞形态发生明显改变。对照组HSC呈星形，芒状突起丰富，高倍镜下细胞核呈圆形或不规则形，核仁圆形，清晰可见。苦参碱作用组较对照组细胞明显减少，细胞间隙较宽，细胞呈圆形，细胞内出现大量空泡，随苦参碱浓度增加，上述改变愈加明显(图1)。A:空白对照组; B：苦参碱作用组.2.2 TUNEL法检测HSC

9、的凋亡 A，B，C，D组HSC凋亡率为(0.76±0.35)%，(4.42±1.59)%，(7.83±1.60)%，(15.92±1.57)%。B，C，D组与A组比较，差别具有统计学意义(H=17.86，P<0.01)。D组HSC凋亡率最高(图2)。光镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞. A：对照组;B：0.12 mg/mL苦参碱组;C：0.24 mg/mL苦参碱组;D：0.48 mg/mL苦参碱组.2.3 RT-PCR法检测NGF，p75，Caspase-3 mRNA表达2.3.1 RT-PCR检测NGF mRNA表达 B，C，D组

10、NGF mRNA表达分别为(0.409±0.074)，(0.724±0.109)，(0.560±0.104)，与A组(0.291±0.086)比较，差别有统计学意义(F=83.908，P<0.01)。C组NGF mRNA表达最高(图3A)。2.3.2 RT-PCR检测p75 mRNA表达 B，C，D组p75 mRNA表达分别为(0.156±0.028)，(0.562±0.097)，(0.190±0.079)。与A组(0.079±0.016)比较，差别有统计学意义(F=231.776，P<0.01)。C组

11、p75 mRNA表达最高(图3B)。2.3.3 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达 B，C，D组Caspase-3 mRNA表达分别为(0.358±0.065)，(1.051±0.113)，(0.661±0.072)。与A组(0.358±0.065)比较，差别有统计学意义(F=126.271，P<0.01)。C组Caspase-3 mRNA表达最高(图3C)。2.4 免疫细胞化学法检测NGF，p75，Caspase-3蛋白表达2.4.1 NGF蛋白表达 NGF在细胞质表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，C，D组NGF蛋白表达分别为(1.750±0.156)，(2.140±0.186)，(2.810±0.198)，(1.850±0.149)。与A组比较，B，C，D组的NGF蛋白表达增加，差别有统计学意义(F=68.724，P<0.01)。C组NGF表达最强(图4A)。2.4.2 p75蛋白表达 p75在细胞核表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，C，D组p75蛋白表达分别为(1.710±0.157)，(2.21