塞来昔布联合卡培他滨对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影

1、塞来昔布联合卡培他滨对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响         10-05-10 15:20:00     编辑：studa20                 作者：黄新余，王洪成，潘烨，戚大川，艾开兴，郑起【摘要】  目的 研究环氧化酶-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)和化疗药物卡培

2、他滨(Capecitabine)对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法 建立LIC-D35裸鼠人肝癌模型，成瘤后40只裸鼠随机分成4组即对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组(卡培他滨与塞来昔布)。观察肿瘤大小，计算抑瘤率;采用RT-PCR方法观察肿瘤中COX-2的mRNA表达，并应用免疫组化法Ki-67检测肿瘤细胞增殖水平、末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果 对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组瘤体体积分别为(3 880±438)mm3、(3 374±465)mm3、(1 859±362)mm3和(981±197)

3、mm3;塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组抑瘤率分别为15%、45%和71%。四组中Ki-67阳性率分别为46%、32%、25%和11%;肿瘤细胞凋亡指数DI分别为8%、22%、27%和38%;塞来昔布组、联合组肿瘤组织中COX-2 mRNA表达显著低于对照组和卡培他滨组(P<0.01)。结论 塞来昔布可显著抑制裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞COX-2 mRNA表达，抑制肿瘤细胞Ki-67表达，诱导肿瘤细胞凋亡。与卡培他滨联合应用可提高抗肿瘤效果。 【关键词】  环氧化酶-2抑制剂;裸鼠;肝肿瘤Abstract Objective To evaluate the effect of

4、celecoxib combined with capecitabine on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma in nude mice.Methods LIC-D35 liver tumors were orthotopically implanted in 40 nude mice and divided randomly into 4 groups:the control group(A)，the celecoxib group(B)，the capecitabine group(C)and the cele

5、coxib combined with capecitabine group(D).Results Tumor volume was(3 880±438)mm3，(3 374±465)mm3，(1 859±362)mm3，(981±197)mm3 in the control，celecoxib，capecitabine and combined group，respectively.The rate of tumor inhibition was 15% in the celecoxib group，45% in the capecitabine gr

6、oup and 71% in the combined group.Immunohistochemical assays for tumor proliferation(Ki-67)showed the tumor cell proliferation Ki-67 positive rate was 46%,32%,25%，11% respectively and apoptosis index(TUNEL)was 8%，22%，27%，38%，respectively.The expression of COX-2 mRNA by RT-PCR method in celecoxib gro

7、up and combined group showed it was highly suppressed compared with the control group and capecitabine group.Conclusion Celecoxib can suppress the expression of COX-2 mRNA of tumors orthotopic implanted in nude mice，it reduce proliferation and induce apoptosis of tumor cell;By combine with capecitab

8、ine，it can improve its anti-tumor activities.Key words COX-2 inhibitor;nude mice;hepatocellular carcinoma研究表明，环氧化酶-2抑制剂可抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤细胞凋亡1。近来研究发现环氧化酶抑制剂可增强肿瘤放射和化疗敏感性2，3。但也有不同报道。文献中环氧化酶-2抑制剂在肝癌中的研究报道很少，其抗癌作用机制尚不清楚。本实验采用人肝癌裸鼠模型(LIC-D35)，对塞来昔布联合卡培他滨在人肝癌裸鼠模型中肿瘤抑制作用进行研究，并探讨其作用机制。1 材料与方法1.1 构建人肝癌裸鼠模型 BALB/c

9、裸小鼠(中科院上海实验动物中心提供)，40只均为雄性，SPF级，4 6周龄，体质量约1820 g。取人肝癌裸鼠转移模型LIC-D35 瘤源(复旦大学肝癌研究所瘤源)按照规范原位接种于裸鼠肝左叶内。成瘤率达100%。随机分成4组：对照组(生理盐水)、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组，每组各10只。1.2 相关药物及试剂 塞来昔布购自美国辉瑞公司，卡培他滨为瑞士罗氏公司产品，Ki-67试剂盒、TUNEL试剂盒均为DAKO公司产品。Tripure总RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录酶、Taq酶、RNA酶抑制剂(均购自美国Promega公司);COX-2引物(上海生物工程公司合成)，上游引物:5-CAG

10、CACTTCACGCATCAGTT-3，下游引物:5-TCTGGTCAATGGAAGCCTGT-3，产物片段长342 bp。1.3 实验方法 肿瘤种植术后5天开始治疗。对照组蒸馏水灌胃，每只0.3 ml/d，连续3周;塞来昔布组用Celecoxib灌胃，每只25 mg/(kg·d)，连续3周;卡培他滨组用Capecitabine 1.8 mmol/(kg·d)，连续3周灌胃、联合组Celecoxib和Capecitabine，用药剂量及给药途径与单独用药组相同。实验第42天用颈椎脱臼法处死所有模型鼠。用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤体积(V)，V=长径×短径2

11、/2。肿瘤抑制率=(对照组体积-实验组体积)/空白对照组体积×100%。将标本一半放置液氮中保存，一半置于中性福尔马林中固定。1.4 免疫组织化学染色 肿瘤组织经10%甲醛固定后，石蜡包埋，4 m厚连续切片。用免疫组化法Ki-67检测肿瘤细胞增殖水平、Ki-67 阳性为细胞核染为棕黄或棕褐色，每例切片观察5 个高倍视野，每个视野计100 个细胞中阳性细胞所占百分比。细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNEL)，按TUNEL试剂盒说明书进行，以细胞核呈棕黄色颗粒状为阳性凋亡细胞，在光镜下(×400)随机选取5个视野对凋亡细胞进行计数，并以AI表示凋亡细胞的多少，即1

12、00个完整细胞中平均凋亡细胞数的百分数表示。1.5 RT-PCR 检测COX-2 mRNA表达。(1)总RNA的提取：按Tripure试剂说明书进行。琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测定260 nm/280 nm的吸收峰值以确定RNA的含量和纯度，将RNA调整至1 g/l。(2)cDNA合成:依次加入MgCl2(25 mmol/L)2 l、dNTPs(各10 mmol/L)1 l，RNAsin(40 U/ml)0.25 l、反转录酶XL(5 U/m 0.5l 0)、随机引物0.5 l，37 温浴1 h，合成cDNA。(3)PCR反应:以同一cDNA为模板，在30 l反应体系内扩增COX-2。循环条件：95 预变性5 min后，95 50 s，55 1 min，72 1 min，