CalphostinC抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附

1、Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附 10-09-13 10:20:00 编辑：studa20 作者：王中群 崔静 李丽华 赵卫星 赵琪 苏蔚 申虎 位冒冒【摘要】 目的 探讨酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)诱导内皮单核细胞黏附的机制及Calphostin C的干预效果。方法 采用体外培养和直接计数法观察荷脂ECV304内皮细胞黏附能力的变化；PepTagRAssay法定性内皮细胞胞膜蛋白激酶C(PKC)活性状态；RTPCR和Western印迹检测细胞间黏附分子1(ICAM1)和抑制性蛋白B(IB)表达的变化。结果 ELDL呈剂量依赖性增强内皮单核细胞间的黏附，

2、其活化内皮促进黏附的理想剂量为2040 g/ml浓度。另外，ELDL还可显著活化内皮细胞胞膜PKC，下调IB的表达而增强ICAM1的表达。应用PKC特异性抑制剂Calphostin C干预后，荷载25 g/ml ELDL 8 h的ECV304内皮细胞ICAM1表达下调而IB则反相上调，黏附能力也在Calphostin C达到100 nmol/L浓度时显著下调，细胞状态明显好转；且200400 nmol/L Calphostin C基本可以逆转ELDL对内皮细胞的影响。结论 内皮细胞黏附能力的强效促进剂ELDL可能是通过PKC/NFB/ICAM1发挥作用的，针对PKC靶酶的特异性抑制剂Calph

3、ostin C可以有效地抑制由ELDL引起的内皮活化黏附增强。 【关键词】 Calphostin C；低密度脂蛋白，酶修饰；细胞间黏附分子1；黏附；内皮细胞单核细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞的黏附是动脉粥样硬化性心脑血管病的重要早期事件1，探讨病理状态下细胞与细胞间的黏附机制，并进而采取相应的干预措施，尤其是早期的药物干预，将会有效地预防该类疾病的发生。为此，本研究拟在课题组前期高脂血症影响内皮功能、促进脂纹和斑块形成的基础上2，以酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)处理ECV304人脐静脉内皮细胞，观察其黏附能力及相关指标，细胞间黏附分子1(ICAM1)、抑制性蛋白B(IB)和蛋白激酶C(PKC

4、)的改变，并进而以PKC的特异性抑制剂Calphostin C进行相应干预，试图为黏附干预药物的体外研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 THP1单核细胞和ECV304脐静脉内皮细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)；Calphostin C(购自Biomol公司)。总RNA提取试剂盒TRIzol(购自上海Sangon公司)；ImPromIITM Reverse Transcriptase、PepTagRNonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit(购自Promega)；MasterMix一管便捷式PCR扩增

5、试剂盒(购自北京天为时代)；所有引物(由上海生工生物工程服务有限公司合成)；IB和ICAM1一抗，Western印迹Luminol Reagent(购自Santa Cruz)；辣根过氧化物酶标记二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司)；其他试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 低密度脂蛋白(LDL)的分离、酶修饰及鉴定 参考文献3的方法制备ELDL。取新鲜人血浆100200 ml，加入PDB以防腐抗氧化。置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200 mol/L EDTA的磷酸缓冲液(PBS)液中透析48 h后，加入胰蛋白酶(6.6 g/ml)和胆固醇脂酶(40 g/ml)共孵育48h后，获得

6、ELDL。BCA法蛋白定量，鉴定后过滤除菌，调蛋白浓度至1 g/L，4保存，1 w内使用。 1.3 实验分组 本研究分为两个部分，首先以ELDL浓度梯度(0、5、10、20、40 g/ml)处理ECV304内皮细胞8 h。在观察到内皮细胞黏附功能和胞膜PKC活性的变化后，为了进一步明确ELDL诱导黏附的可能机制以及PKC和黏附的关系，遂以PKC的特异性抑制剂Calphostin C 处理荷载ELDL的ECV304内皮细胞。分组情况：25 g/ml ELDL +10 l DMSO孵育细胞8 h；25 g/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；25 g/ml

7、ELDL+50 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；25 g/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；25 g/ml ELDL+200 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h；25 g/ml ELDL+400 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h。加入处理因素后每组细胞均在距20 W Philip荧光灯10 cm处照射大约30 min，以激活CalphostinC的药物活性。 1.4 细胞黏附实验 参考文献4并加以改进。向生长于24孔板并融合至80%的ECV304细胞中分别加入上述处理因素培养8 h后，加入4

8、106个/mlTHP1单核细胞悬液800 l/孔，37 孵育30 min，吸弃培养基，预热PBS洗2次去除未黏附细胞，4%多聚甲醛固定细胞，显微镜计算机图像分析系统计数黏附细胞，方法为每个孔分别计数上、中、下、左、右每个视野的ECV304和THP1细胞数，5个视野单核细胞数/内皮细胞平均后即得到各个孔每个视野每个ECV304内皮细胞黏附的THP1单核细胞数目。试验重复3次。内皮细胞的黏附能力(Adhesion ability)用每个内皮细胞黏附的单核细胞数目来表示。 1.5 PepTagRAssay 参照文献5进行。将经过处理8 h的ECV304细胞分别提取胞浆胞膜蛋白。BCA蛋白检测试剂盒定

9、量后按照PepTagRAssay Kit说明进行如下操作。取9 l胞膜蛋白粗提液加入到16 l经过30 2 min的PKC活性检测反应液，混匀后构成25 l的反应体系(阴性对照则将9 l未变性胞膜蛋白的粗提液替换为9 l去离子水)；30 30 min，95 10 min。4避光保存。取5 l反应终产物0.8%的琼脂糖凝胶100 V的电压条件下水平电泳15 min。终止电泳后UVP凝胶电泳分析系统摄像，显示胞膜PKC磷酸化与非磷酸化条带。 1.6 逆转录聚合酶链反应RTPCR 用TRIzol试剂提取经过1.3处理细胞的总RNA，溶于无RNA酶水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值在

10、1.82.0之间。取总RNA 2 g，用ImPromIITM Reverse Transcriptase合成cDNA，再取逆转录产物10 l进行PCR循环。ICAM1引物序列5CAGTCACCTATGGCAACGAC3(正义)，5ATTCAGCGTCACCTTGGCTC3(反义)，243 bp；actin 引物序列 5ATCCCTGTACGCCTCTGG3(正义)，5TCCTTCTGCATCCTGTCG3(反义),500 bp。PCR反应条件为：95 5 min预变性，95 30 s变性，60 30 s退火，72 1 min延伸，35个循环，72 5 min继续延伸。IB引物：5CGTTCCT

11、GCACTTGGCCATC3(正义)，5GTCCGGCCATTACAGGGCTC3(反义)；94 30 s，55 45 s，72 1 min,共32个循环，409 bp。反应结束后，取RTPCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为10 l，溴化乙锭染色。电泳条带采用UVP凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因吸光度值的比值来比较待测基因mRNA的表达差异。 1.7 Western 免疫印迹检测 提取经过处理的细胞总蛋白，BCA蛋白定量并煮沸变性后，参考文献6进行IB和ICAM1的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用UVP凝胶图像分析系统分析。以对照组的面积灰度值为

12、100%，与实验组进行比较和半定量分析。 1.8 统计学处理 数据用xs表示，组间比较采用方差分析及t检验，由SPSS11.0统计软件完成。 2 结 果 2.1 ELDL增强内皮单核细胞的黏附 倒置生物光学显微镜下可见未加处理因素的对照组内皮细胞呈胖梭形铺路石样外观，单核细胞小圆形、透亮，生长状态良好。用ELDL37孵育8 h后，ECV304内皮细胞黏附的单核细胞数目明显增加；细胞计数显示ELDL呈剂量依赖性的方式增强内皮单核细胞的黏附。由表1可见：随着ELDL浓度由0上升到20 g/ml，内皮细胞的黏附能力也增加了2.5倍；但20 g/ml ELDL处理组与40 g/mlELDL处理组内皮细

13、胞的黏附能力差异不显著(P0.05)，显示该浓度的处理已使内皮细胞的黏附能力进入到了一个相对稳定的平台期。 2.2 ELDL促进内皮细胞PKC的活化 随着ELDL浓度的增加，ECV304内皮细胞PKC活性的磷酸化区带亮度越来越强。不过在20 g/mlELDL处理组与40 g/mlELDL处理组内皮细胞PKC活性基本趋于稳定(图1)。 2.3 ELDL影响黏附相关因子IB和ICAM1的表达 ELDL抑制IB mRNA的表达(呈剂量依赖性的方式)，促进ICAM1mRNA的表达(图2，表1)。但在5、10和20 g/ml ELDL处理组间ICAM1mRNA的表达差异不显著(P0.05)。Wester

14、n印迹结果显示ELDL处理对ECV304内皮细胞IB和ICAM1表达影响的整体趋势与RTPCR结果基本吻合。 2.4 Calphostin C抑制荷载ELDL内皮细胞黏附能力的增强 倒置生物光学显微镜下可见随着Calphostin C浓度的增加，荷载25 g/mlELDL 8 h的ECV304内皮细胞开始由瘦梭形转变为胖梭形，胞浆内脂滴等异常物质的蓄积也开始减少。当Calphostin C浓度增至100 nmol/L时，黏附单核细胞的能力明显降低(表2)，细胞状态也明显好转；当Calphostin C浓度增至400 nmol/L时，内皮细胞的黏附能力基本被逆转至未荷载ELDL的基线水平之下(P

15、0.01)(图3，表1和表2)。 2.5 Calphostin C抑制ELDL对IB和ICAM1mRNA影响 随着Calphostin C浓度的增加，荷载25 g/mlELDL 8 h的ECV304内皮细胞IB mRNA的表达上调，ICAM1 mRNA表达下调，而且这种上调或下调在200400 nmol/L CalphostinC时基本趋于稳定，25 g/ml ELDL+200与400 nmol/L CalphostinC两组间表达无显著差异(P0.05)(表2和图4)。 表1 ELDL对细胞黏附能力及IB和ICAM1 mRNA表达水平的影响表2 Calphostin C对荷载ELDL的ECV304内皮细胞黏附能力及IB和ICAM1 mRNA表达水平的影响(xs) 3 讨 论 细胞黏附是多种急慢性心血管疾病(如动脉粥样硬化、血栓形成