丙戊酸钠对内毒素诱导的大鼠多器官功能障碍的作用

1、丙戊酸钠对内毒素诱导的大鼠多器官功能障碍的作用姜远旭 丁泽君 尚游 袁世荧 姚尚龙【摘要】目的 研究丙戊酸钠（valproic acid,VPA）对内毒素诱导的大鼠多器官功能障碍的影响。方法 40只雄性清洁级Wistar大鼠，随机分为四组(n=10)，生理盐水（NS）对照组、丙戊酸钠（NS+VPA）对照组、脂多糖（LPS）组、丙戊酸钠（LPS+VPA）处理组。NS组静脉注射生理盐水1ml/kg；NS+VPA组静脉注射生理盐水1ml/kg后，立即静脉注射VPA300mg/kg；LPS组静脉注射LPS10mg/kg；LPS+VPA组静脉注射LPS10mg/kg后，立即静脉注射VPA300mg/kg

2、。所有动物进行颈动脉插管接换能器测平均动脉压和心率。注射NS或LPS后6小时处死动物，光镜下观察肺、肾、肝组织病理学变化，处死前即刻抽颈动脉血做血气分析，测定血清中尿素氮(BUN)、肌酐（Cr ）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量及肿瘤坏死因子-a （TNF-a）和白细胞介素-1（IL-1）的浓度。结果 LPS组出现明显的低血压和低氧血症，组织学检查发现明显的肺、肾、肝组织病理学改变, 应用VPA后各项指标明显改善（P<0.05）。LPS组血清中BUN 、Cr、TNF-a、IL-1的浓度明显升高,应用VPA后各项指标浓度显著降低（P<0.05）。结论V

3、PA内毒素诱导的大鼠多器官功能障碍具有保护作用，其机制与抑制炎性细胞因子的释放有关。 【关键词】丙戊酸钠；内毒素血症；多器官功能障碍Effects of valproic acid on endotoxin induced multiple organ dysfunction in rats JIANG Yuan-xu, DING Ze-jun , SHANG You , et al. Department of Anesthesiology, Union Hospital, Tongji Medical college, Hua zhong University of Science and

4、 Technology, Wuhan 430022,ChinaCorresponding author: YUAN Shi-Ying(E-mail：yuan_shiying)【Abstract】 Objective To investigate effects of valproic acid on multiple organ dysfunction induced by endotoxin in rats. Methods Forty male Wistar rats were randomly divided into four group (n=10 per group)： NS co

5、ntrol group (1ml/kg NS intravenously), VPA control group (1ml/kg NS +300mg/kg VPA intravenously), LPS group(10mg/kg LPS intravenously), LPS+VPA group(10mg/kg LPS +300mg/kg VPA intravenously).The arterial catheter was connected to a pressure transducer for the measurement of mean arterial pressure (M

6、AP)and heart rate（HR）for 6 hrs in all groups. Rats were sacrificed 6 hours after NS or LPS treatment. Arterial blood samples were drawn immediately before sacrifice for blood gas analysis and measurement of BUN, Cr , ALT，AST , TNF-a，IL-1 concentrations. Lungs, kindey，livers were removed immediately

7、after sacrifice for evaluation histological injury. Results The administration of LPS produced a marked hypotension and hypoxemia and resulted in histopathologic damage to the lungs , kindey, livers,but these changes were ameliorated by VPA treatment (P<0.05). BUN,Cr, ALT ,AST , TNF-a, IL-1increa

8、sed significantly in LPS group rats,but VPA trement could lower its level(P<0.05). Conclusion VPA treatment has a protective effects on multiple organ dysfunction induced by endotoxin in rats,which is associated with its inhibition of proinflammatory cytokines .【Krey wods】Valproic acid；Endotoxemi

9、a； Multiple organ dysfunction作者单位：430022武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科通信作者：袁世荧 E-mail：yuan_shiying机体受到感染、创伤、休克等严重损伤后，可能导致多器(近年来，对多器官功能障碍进行了大量的临床和实验研究，目前尚未找到满意的解决方法，其病死率仍高达60%-94%（1）。因此，寻求新的治疗措施显得尤为重要。 丙戊酸钠（valproic acid,VPA）是由8个碳原子和脂肪酸支链组成的简单化合物，临床上主要用于治疗癫痫、偏头痛等疾病。最近研究发现，VPA对由细菌性感染、失血性休克、创伤引起的脏器损害具有保护作用（2-

10、5）。本文拟通过静脉注射脂多糖诱导多器官障碍模型，观察VPA对内毒素所致的大鼠多脏器功能障碍的作用。1 材料与方法1.1 实验材料 脂多糖（LPS E. coli serotype 0127:B8, Sigma 公司，美国)；丙戊酸钠 (Glaxo Wellcome 公司,法国)；TNF-a、IL-1 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；血气分析仪（EHSY公司，美国）；监护仪（Spacelab 公司，美国）1.2 模型制备及分组 清洁级雄性Wistar大鼠,体重200-250 g (由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。随机分为4组(n=10):生理盐水对照组(NS组)、丙

11、戊酸钠对照（NS+VPA）组、脂多糖组(LPS组) 、丙戊酸钠处理组(LPS+ VPA组)。实验前动物自由进食水。20%乌拉坦1.3mg/kg腹腔注射麻醉，分离右颈总动脉和左股静脉，置入22号套管针，分别用于测量血流动力学和给药用。NS组股静脉注射生理盐水1ml/kg, NS+VPA组股静脉注射生理盐水1ml/kg后，立即注射VPA300mg/kg ，LPS组股静脉注射脂多糖10mg/kg复制多器官障碍模型，LPS+ VPA组股静脉注射LPS10mg/kg后，立即注射VPA300mg/kg。注射生理盐水或LPS 6小时后颈动脉放血处死动物并采集标本。1.3 观察指标 （1）血流动力学监测 套管

12、针置入颈动脉后接换能器测压，平稳20分钟后给予NS或LPS并记录第一次平均动脉压和心率，以后每隔60分钟记录一次直到实验结束。（2） 血气分析 在大鼠处死前，用肝素注射器经套管针抽血0.5 ml，做血气分析检测血氧分压（PaO2）、肺泡动脉氧分压差（A-aDO2）、乳酸(Lac)。 （3） 生化指标的检测 放血处死动物前取动脉血3ml，静置30分钟后离心取血清用于测量BUN、Cr、ALT、AST。（4）血液中TNF-a、IL-1的浓度 放血处死动物前取动脉血2ml,静置30分钟后离心取血清-20冻存。采用酶联免疫吸附法测定TNF-a、IL-1的浓度，严格按照说明书进行操作。（5）组织学检测 动

13、物处死后，取部分肺、肾、肝组织，10%的多聚甲醛固定3天,给予脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片（厚度4 m），苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,H-E）染色。光镜下观察组织学变化。统计学处理 计量资料以均数±标准差(±s) 表示,采用SPSS10. 0 统计软件行单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。2 结 果血流动力学 各组间平均动脉压（MAP）和心率(HR)的基础值无明显不同，与对照组比较，注射LPS后血压在1小时内下降30±5mmHg，随后有缓慢的回升，到3小时末持续下降，到6小时末为79±4mmHg（P

14、<0.05）。LPS后心率1小时内下降 ，随后也有缓慢的回升，到3小时末持续下降，到6小时末为229±20次/min,（P<0.05）。与LPS组比较，丙戊酸钠治疗组MAP明显升高，到6小时末为105±5mmHg（P<0.05），但丙戊酸钠治疗并不能使HR明显增快, 到6小时末为241±27次/min（P>0.05），见表1，2。血气分析 各组间PaO2、A-aDO2、Lac础值无明显不同。与NS对照组比较，静脉注射LPS后PaO2明显降低，A-aDO2、Lac值明显增大。与LPS组比较，丙戊酸钠治疗组PaO2升高，A-aDO2减小，Lac

15、值降低 (P<0.05),见表3。生化指标 与对照组比较，静脉注射LPS引起了血清中BUN、Cr、ALT、AST明显增高（P<0.05）。VPA治疗使上述指标降低（P<0.05）,见表4。血清中TNF-a、IL-1的含量 与NS组比较，LPS组血中TNF-a、IL-1的含量显著升高（P<0.05）。VPA治疗使TNF-a、IL-1的含量明显降低（P<0.05），见表4。组织学变化 光镜下显示肺、肾、肝、正常的组织学变化（见图 A、E、I）。静脉注射LPS后出现明显的肺、肾、肝病理学改变：肺泡壁水肿、肺间质增厚和炎性细胞浸润，肺泡结构破坏（见图C）；肾小球体积增大，

16、系膜细胞增生，炎性细胞浸润（见图G）。肝小叶内有炎性细胞浸润，肝窦充血，肝细胞坏死（见图K）；给予VPA治疗后上述器官病理学改变改善:肺泡壁水肿减轻，炎性细胞浸润减少；肝细胞坏死程度减轻；肾小球炎性细胞浸润减少，系膜细胞增生减少（见图 D、H、L）。3 讨 论革兰氏阴性细菌所致内毒素血症常导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS），造成肺、肾、肝等多器官损伤，是ICU中危重病人死亡的主要原因。我们的实验以大鼠为研究对象，通过静脉注射LPS复制多器官功能障碍模型。静脉注射10mg/kg的LPS后，LPS组大鼠的PaO2明显降

17、低，A-aDO2明显增大，Lac升高，血清中BUN、Cr、ALT、AST的浓度大量增加。这些指标的变化分别表明了LPS组大鼠肺、肾和肝功能遭受到损害。同时，其各自的组织学结果也表明静脉注射LPS能成功复制多器官功能障碍模型。VPA已应用于临床多年，有很好的安全性，主要用于治疗癫痫、偏头痛等疾病。近年发现VPA对多种脏器发挥保护作用。在永久性鼠脑缺血和脑缺血再灌注模型中，给予VPA能够减少炎性细胞的浸润，减少脑梗死面积（2-3）；在狗的低温循环骤停模型中，给予VPA能够阻止大脑损伤（6）。在鼠的失血性休克模型中，VPA治疗具有器官保护作用及提高鼠的生存率（7-9）。在不同的实验性鼠肠炎模型中，V

18、PA通过诱导过度激活的炎性细胞凋亡和抑制炎性细胞因子的释放而发挥脏器保护作用。而VPA是否能够对多器官功能障碍具有保护作用仍不清楚。因此，我们的实验观察了VPA对内毒素血症引起的多器官功能障碍的影响。结果表明：给予VPA后大鼠的MAP明显升高；PaO2 上升，A-aDO2差值减小，Lac降低；血清中BUN、Cr、ALT、AST的浓度明显降低；内毒素引起的肺、肾、肝组织的病理性损伤明显减轻。这些结果表明VPA能够减轻内毒素所致的多器官功能障碍。LPS存在于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜，它能够快速激活机体固有免疫系统，导致大量致炎性细胞因子（如TNF-a、IL-1）的释放。大量研究表明：TNF-a、I

19、L-1是炎症启动细胞因子，它的主要作用是诱导内皮细胞粘附分子的表达及促进中性粒细胞的组织浸润，从而引起组织细胞损伤。以往的研究表明：VPA通过抑制TNF-a、IL-1等致炎细胞因子的释放而发挥抗炎作用（10-11）我们在实验中观察到：对照组血清TNF-a、IL-1的含量很低。注射LPS后，TNF-a、IL-1的含量极大升高。VPA处理后，血清TNF-a、IL-1的含量降低。这些表明VPA可能通过抑制致炎细胞因子的释放发挥其减轻内毒素对多个器官损害的作用。VPA抑制致炎细胞因子释放的机制尚不太明了，体内外研究表明：VPA能够抑制组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）(12-14）。HDACs抑制后使某些

20、组蛋白（如热休克蛋白70、超氧化物歧化酶等）发生乙酰化，基因转录激活，从而间接发挥抗炎及细胞保护作用。另外，HDACs抑制后也能使某些非组蛋白（如转录因子NF-B p65等）乙酰化，从而减少NF-B与DNA的结合，NF-KB的转录活性下降,使得NF-B依赖的炎性细胞因子（如TNF-a、IL-1等）释放减少，这可能是HDACs抑制剂发挥抗炎作用的一个重要途径。因此，VPA抑制致炎细胞因子释放的机制可能与其抑制HDACs有关。总之，VPA对LPS诱导的多器官功能障碍有保护作用，其机制与抑制炎性细胞因子的释放有关。参 考 文 献1 Johnson D,Mayers I.Mutiple organ d

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29、ia in rats: potential roles of histone deacetylase inhibition and heat shock protein induction. J Neurochem,2004, 89:13581367.附图表表1 各组不同时间点平均动脉压变化比较(±s)组别060120 180240300 360NS组NS+VPA组LPS组LPS+VPA组124±3124±3125±2124±2124±2122±595±7*108±4*#128±3127

30、7;4105±3*112±5*#119±4119±4111±5*115±3*#125±2125±2103±4*112±4*#123±3123±394±3*110±5*#125±3123±379±4*105±3*#与NS组比较,*P<0.05 ；与LPS组比较,# P<0.05 表2 各组不同时间点心率变化比较(±s)组别060120180240300360NS组NS+VPA组LPS组LPS+VPA组367±14361±15349±23351±25331±19341±30324±23*327±22*348±28351±25410±20*422±24*#369±18376±20409±41*428±31*#340±24341±21309±21*320±20*#342±20341±20276±7*287±18*#346±213