G显带染色体脱色FISH技术在识别胃癌标记染色体中的应用

1、G显带染色体脱色FISH技术在识别胃癌标记染色体中的应用【摘要】目的应用一种能快速、准确识别胃癌标记染色体来源的技术，以提高对胃癌细胞复杂染色体畸变辨认的能力。方法采用改良的G显带染色体标本脱色后进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)，分别对胃癌细胞系SGC-7901的两条标记染色体(M1和M2)和一例原发性胃癌的标记染色体(M3)进行分析。结果显示了M1、M2和M3有复杂的染色体结构畸变：del(7)(p15)/del(7)(q22);t(1;3)(p11;q11)和del(7)(q32)。结论该方法具有信号强、背景低和重复性好等

2、优点，在识别胃癌染色体复杂结构改变中具有重要的作用。【关键词】染色体畸变；细胞遗传学；荧光原位杂交 The application of fluorescence in situ hybridization performed on the decolorized G-banding chromosomes in detecting the marker chromosomes of gastric cancerXIA Jianchuan(Department of Pathology, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Scie

3、nce, Guangzhou, Guangdong, 510060 P. R. China. E-mail: xiajc51)ZHANG Jianhua(Health Department of Jiangxi, Nanchang, Jiangxi, 330046 P. R. China)GUAN Xinyuan(Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Research Institute, USA)WANG Huiyun(Laboratory of Medical G

4、enetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)LIU Quanzhang(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)ZHANG Guiyin(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. Ch

5、ina)LI Pu(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)【Abstract】ObjectiveUsing a rapid, accurate method that detects the marker chromosomes of gastric cancer and enhancing the ability of discriminating complicated chromosome rearrangements of g

6、astric cancer. MethodsThe improved method of fluorescence in situ hybridization(FISH) performed on the decolorized G-banding chromosome was used. ResultsThe changes of two marker chromosomes (M1, M2) of the cell line(SGC-7901) of gastric cancer and one marker chromosomes(M3) of one primary gastric c

7、ancer were respectively analyzed by this method. The M1, M2 and M3 had complicated structural chromosome aberrations: del(7)(p15)/del(7)(q22), t(1;3)(p11;q11) and del(7)(q32). ConclusionThis method showed strong signals, low backgrounds and well-repetitions. It may play an important part in explorin

8、g the chromosome rearrangements in the process of pathogenesis and development of gastric cancer.【Key words】chromosome aberration;cytogenetics;fluorescence in situ hybridization* Project No. 39270398, supported by the National Natural Science Foundation of China荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridizat

9、ion,FISH)技术与常规的细胞遗传学技术的有机结合，提高了人们对染色体缺失、重复、易位以及来源不清的标记染色体的识别能力。肿瘤特征性的染色体异常，通常表明癌基因和抑癌基因的位点。例如：染色体缺失，常常包括抑癌基因的丢失，而染色体易位常导致原癌基因的激活。因此，建立一种能快速、准确识别肿瘤标记染色体的方法，对探讨染色体畸变在肿瘤发生发展中的作用具有重要意义。1材料和方法1.1标本胃癌细胞系SGC-7901和原发性胃癌分别由中国医科大学遗传研究室和哈尔滨医科大学附属二院腹外科提供。1.2染色体涂染探针由美国国立卫生院，国家人类基因组研究中心，肿瘤遗传研究室关新元博士惠赠，探针用显微切割获得1。

10、1.3胃癌细胞系的染色体制备及G显带按常规方法复苏胃癌细胞系，待复苏细胞生长旺盛时收获，并按常规法制备染色体。一部分片子在室温下老化23 d，置-20 备用，另一部分在75 拷片2 h后，0.025%胰酶液中处理6090 s，生理盐水漂洗，Giemsa染色35 min；对染色体分散好、G显带清晰者进行显微照相。冲洗放大后，按ISCN(1995)标准进行核型分析。1.4原发性胃癌染色体直接制备及G显带从手术刚切除的新鲜标本上切取12 cm3的胃癌组织，置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内，用眼科剪剔除非肿瘤组织及肿瘤坏死组织。将余下的肿瘤组织用37 预温的RPMI-1640培养液

11、反复洗涤23次。将选取的肿瘤组织尽快剪碎。将细胞悬液及组织置于两个离心管中，分别加入37 预温的RPMI-1640培养液10 ml刻度处，加入秋水仙素，使终浓度达到1 g/ml。将标本在37恒温水浴箱内培养11.5 h。离心(1500 r/min)8 min。去上清液，加入37 预温的低渗液(0.4%氯化钾0.4%枸橼酸三钠11)至10 ml，用吸管均匀吸打细胞，混匀，37 温育1015 min。离心(1500r/min)8 min。去上清液，进行第2次低渗(时间同上)。加入12 ml新鲜的固定液(甲醇冰醋酸31)，混匀后立即离心。弃上清液，加入10 ml固定液，轻轻混匀(不可用力吹打)，室温

12、固定1520 min后离心。弃上清液，加入12 ml固定液，常规法滴片。G显带和染色体分析与细胞系的相同。1.5探针的生物素标记及标记物检测采用缺口平移法，以biotin-14-dATP标记探针(按GIBCO BRL公司提供的方法)。用0.8%琼脂糖/TAE缓冲液凝胶电泳检测标记产物。以DNA片段长度300500 bp为宜，如片段较大，则应补加适量的DNase 继续酶切，直至DNA长度适中后，加5 l终止缓冲液(300 nmol/L EDTA)终止反应。1.6荧光原位杂交1.6.1标本的预处理将G显带标本在甲醇中脱色两次，每次5 min，75%、85%、100%酒精脱水各2 min，室温气干；

13、在新鲜的固定液中(甲醇冰醋酸31)固定10 min，室温气干；甲醛(1% formaldehyde in 1PBS/MgCl2)再固定20 min，在1PBS液中洗3次，每次5 min，酒精系列脱水各5 min，室温气干。1.6.2标本变性将预处理后的标本，置70%甲酰胺/2SSC(75)中变性23 min，立即经70%、85%和100%的冰乙醇脱水各5 min，室温干燥。1.6.3染色体涂染探针变性取2 l生物素标记的涂染探针(10 g/ml)加入Cot DNA(100 g/ml)1 l，加入7 l MM2.1(5.5 ml formamide, 1 g dextran sulfate, 0

14、.5 ml 20SSC)杂交液，在76的恒温水浴箱内变性810 min，置37 水浴箱预复性20 min。1.6.4原位杂交将已变性或预退火的DNA探针滴于已变性并脱水的标本上，盖上盖玻片，rubber cement封片，放置潮湿暗盒中，在37 的恒温箱内杂交1824 h或过液。1.6.5洗脱及免疫荧光检测与信号放大杂交次日，将标本去掉盖玻片，依次于4250 50%甲酰胺2SSC中洗涤4次，每次5 min，在1SSC中洗涤3次，每次5 min，然后将玻片置室温2SSC中漂洗，加100200 l avidin-FITC(4SSC/1%BSA/0.1% Tween 20，按1200400比例稀释)

15、于玻片上，37 温育3060 min。取出标本后，于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗涤3次，每次5 min，再加100200 l anti-avidin(以上述稀释液按1100200稀释)于玻片上，继续于37 温育3060 min。取出标本后，再于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗涤3次，每次5 min，再加入avidin-FITC于37温育3060 min，以放大信号，玻片洗涤同上。1.6.6染色玻片于洗涤液中取出，酒精系列脱水，每次1 min，PI/antifade复染，盖上盖玻片，于荧光显微镜观察结果。1.6.7显微镜观察及显微照相用Zeiss Axio

16、skop 20荧光显微镜观察FISH结果，用Kodak Ektachrome 400ASA彩色负片显微照相，信号的曝光时间为4050 s，复染颜色曝光时间48 s，依荧光强度的不同，曝光时间宜进行适当调整。2结果2.1G显带核型分析我们选用的胃癌细胞系SGC-7901已传了100代以上2，生物学特性稳定。分别对胃癌细胞系和原发性胃癌的3个G显带中期分裂相进行了分析。胃癌细胞系G显带分裂相中有1条小标记染色体(M1)和1条大标记染色体(M2)；原发性胃癌的G显带分裂相中有1条标记染色体(M3)。2.2FISH检测G显带分析提示7号、3号染色体异常，选生物素标记的7号染色体涂染探针，对胃癌细胞系(

17、SGC-7901)G显带脱色的中期分裂相染色体进行FISH，证实M1为1条具有短臂和长臂缺失的7号染色体(1)；选生物素标记的3号染色体涂染探针，对胃癌细胞系SGC-7901的另一个G显带脱色的中期分裂相染色体进行FISH，证实M2为1号染色体长臂(M3) 和3号染色体短臂易位染色体(2)。选生物素标记的7号染色体长臂涂染探针，对原发性胃癌G显带脱色的中期分裂相染色体进行FISH，证实M3为具有长臂缺失的7号染色体(3)。1胃癌细胞SGC-7901 FISH(a)和G显带中期分裂相(b)对照分析探针：生物素标记的7号染色体。箭头所指为3条正常的7号染色体；箭头所指为异常7号染色体(M1)。G显

18、带分析表明：M1为del(7)(p15)/del(7)(q22)。2胃癌细胞系SGC-7901 FISH(a)和G显带中期分裂相(b)对照分析探针：生物素标记的3号染色体；箭头指为正常的3号染色体；箭头所指为4条异常的3号染色体，G显带分析表明，从上到下可见：t(1;3)(p11;q11)(M2);del(3)(q11);t(3;10)(p21;q11);t(3;5)(q11;p11)。3原发性胃癌FISH(a)和G显带中期分裂相(b)对照分析探针：生物素标记7号长臂；箭头所为2条正常的7号染色体长臂；箭头所指为2条异常的染色体长臂，G显带分析表明，从上到下可见：del(7)(q32)(M3)

19、;del(7)(q32)Fig 1The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 7 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed three normal chromosomes 7 () and one abnormal chromosome 7 (M1)().

20、 The structural changes of the M1 by G-banding analysis involved del(7)(p15)/del(7)(q22)Fig 2The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 3 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase sprea

21、d showed one normal chromosome 3 () and four abnormal chromosomes 3 (). The changes of the four abnormal chromosomes 3 by G-banding analysis involved t(1;3)(p11;q11)(M2), del(3)(q11),t(3;10)(p21;q11) and t(3;5)(q11;p11)Fig 3The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of

22、 7q (a) and G-banding on metaphase spread (b) from one primary gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed two normal 7q () and two abnormal 7q(). The structural changes of the two abnormal 7q by G-banding analysis involved del(7)(q32)and del(7)(q32)3讨论G显带脱色FISH技术国内外已有报道。Garson等3报道

23、的G显带法，虽然尽可能地避免了杂交信号的损失，但效果不够理想。Hirai等4建立了可同时观察到FISH杂交的荧光G带技术，在基因组作方面显示了良好的应用前景，却不适合与整条染色体涂染探针的FISH同时使用。我们改良的G显带褪色FISH技术不仅适合染色体涂染探针，也适应于着丝粒探针，在胃癌细胞系和原发性胃癌中都获得了良好结果，与同类技术比有信号强、背景低、重复性好的特点。直接采用FISH识别肿瘤标记染色体来源，面临的最大的问题是探针的选择5。如先对肿瘤的染色体标本进行G显带，可以了解肿瘤细胞整个染色体组的改变情况，为进一步用FISH技术检测提供选择适合探针的信息。然后在原来G显带的核型上，选择适

24、合的探针来证实或辨认G显带分析过程中有疑问的、或不能确认的染色体畸变。对那些仅有部分区带易位的异常染色体，FISH的结果不能直观地鉴别。用G显带标本经脱色后进行FISH的方法，既能直观地鉴别异常染色体，又能准确地描绘染色体缺失或易位的断裂位点。本研究中，SGC-7901细胞系中，出现的标记染色体(M1)，G显带后用生物素标记的7号染色体涂染探针进行FISH，证实是一条结构异常的7号染色体，结合G显带，M1为del(7)(p15)/del(7)(q22)；另一条标记染色体(M2)，G显带后用生物素标记的3号染色体涂染探针进行FISH，证实为1和3号染色体相互易位形成，结合G显带，M2为t(1;3

25、)(p11;q11)；原发性胃癌中，出现的标记染色体(M3)，G显带后用生物素标记的7号染色体长臂涂染探针进行FISH，证实有7号染色体长臂缺失，结合G显带，M3为del(7)(q32)。由此可见，把G显带技术与FISH结合起来，在用少量探针的情况下，能快速、准确地检测肿瘤复杂染色体结构异常。显示了该方法在识别标记染色体来源方面具有独特的优势6，7。G显带脱色FISH技术的关键性步骤：常规G显带的染色体标本经甲醇脱色后，再经常规固定液(甲醇冰醋酸31)和含有少量的MgCl2的甲醛溶液两次固定后再作FISH，能使经胰酶消化过的染色体标本耐受强烈的变性作用而保持良好的形态，避免靶染色体DNA的断裂

26、丢失，在G显带脱色后，能防止杂交信号的损失。一般在甲醛中固定2030 min为宜，对比实验发现，染色体标本的变性时间和甲醛固定呈正相关，这可能与甲醛固定后的染色体蛋白质改变影响染色体变性的时间有关。此外，染色体G显带后标本即时放-20 冰箱保存一年，对探针的杂交质量没有多大影响。但通过油镜观察，照相后的染色体标本不可存放时间太长，过夜后的染色体标本常常影响探针的杂交质量，最有效的办法是显带、染色，照相后立即褪色再做FISH。染色体玻片变性的时间至关重要，变性温度相对低有利于染色体保持良好的形态。研究中发现，染色体标本的变性时间和染色体老化时间呈正相关。老化时间长的片子在相同的变性温度(75)下

27、，可延长一些变性时间。洗脱的温度一般不超过50。这些步骤对G显带标本脱色后进行FISH起着关键性的作用。应用该技术，不仅能通过特异性涂染探针的杂交有效地检测结构复杂的染色体，而且通过G显带分析能对杂交信号进行准确的定位。基金项目：国家自然科学基金(39270398)作者单位：夏建川（510060广州，中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤病理研究室）张建华（江西省卫生厅）关新元（Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Reasearch Institute, USA）刘权章（哈尔

28、滨医科大学医学遗传研究室）张贵寅（哈尔滨医科大学医学遗传研究室）李璞（哈尔滨医科大学医学遗传研究室）参考文献1，Guan XY, Paul S, Meltzer, et al.Rapid generation of whole chromosome painting probes (WCPs) by chromosome microdissection. Genomics, 1994,22101-107.2，Lin CH, Fu ZM, Liu YL, et al.The establishment of human gastric cancer cell line SGC-7901.Tumor J, 1981,11-3.林超鸿，富志民，刘亚伦，等.人体胃腺癌细胞株SGC-7901的建立.肿瘤，1981，11-3.3，Garson JA, Berghe JA, Kemshead JT, et al.Novel non-isotopic in situ hybridization technique detects small (1 kb) unique sequences in routinely G-banded human chromosomes: fine mapping of N-m