dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法

1、DNA1接反应的影响因素娥高平端连接效率的方法的卜源DNA和质粒载体的连接反应&平端DNA连接接反应1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl,较多用50mmol/L,pH的范围在，较多用， 目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2,作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT,较多用10mmol/L,作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有L的ATP现多用1mmol/L,是酶反应所必需的。2、p

2、H的影响：一般将缓冲液的pH调节到，较多用。有实验表明，若把pH为时的酶活力定为100%那么体系偏碱（pH为）时仅为全部活力的65%当体系偏酸（PH为）时仅为全部活力的40%3、ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为/L,过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10喊抑制；还有报道，当ATP的浓度为L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATPM易分解，所以当连接反应失败时，除了DNAW酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20C保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时

3、最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP液。4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DN敏链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37Co为了解决这一矛盾， 在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16C,时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20C30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20C60min能使连接反应进行得更完全一些。 对于平末端是不用考虑氢键问题的， 可使用较高的温度，使

4、酶活力得到更好的发挥。5、酶浓度的影响：日常使用的DN雁度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。6、DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA度还应降低，甚至是DNA勺总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4DNA连接酶对DN袜端的表观Km为L,所以，连

5、接时DNAt度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。提高平端连接效率的方法：1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的。 要看片段具体情况而言， 有时载体和片段浓度过高， 容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNAt段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50-100ngo3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PE印口扩大酶量，

6、22度2小时后4c过夜。4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价链。 如质粒载体的两条链都带5磷酸,可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入后可被修复。相邻的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实

7、际上在有用途中，丁4噬菌体。1人连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA,也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大 （因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这倦，

8、在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前， 某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。 因此在DNA浓度高时， 连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等（1975;同时参见BethesdaRes,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊）从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这

9、样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互彳用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j=3/（3兀lb0）3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值， 对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数，M是DNA的摩尔浓度 （单位：mol/L）。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条

10、件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当ji时，有利于重新环化；当ij,则有利于产生多联体。 图显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为、1、2和5时所需DNA浓度之间关系（Dugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2-3倍 （即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求， 而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源DNA末端浓度的2倍时，有效重

11、组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线壕质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源DNA的量递增时， 这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含:1）足量的载体DNA,以满足j:i1和j:i3。对一个职pUCIL般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60gg/ml。2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA,如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒

12、的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹策略以便通过定向的方法构建重组质粒。（二）粘端连接1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。 如有必要， 可用凝胶电泳分离片段并 （或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。 通过酚： 氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA,然后用TE溶液使其浓度为100/ml。2）按如下所述设立连接反应混合物：a.将区l载体DNA转移到无菌微量中，加等摩尔量的外源DNA。b.加水至区l,于45c加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却至U0C。c.加入：10 xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1lT4噬菌体NDA连接酶单位5mmol/LATP1”于16c温育14小时10 xT4噬菌

13、体DNA连接酶缓冲液200mmol/L同50mmol/KMgCl250mmol/L二硫苏糖醇500g/ml牛血清白蛋白（组分V.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于20C。另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10屋。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除NewEnglandBiolabs公司外）现在都用Weiss等，11968）对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37c下20

14、分钏内催化1mm0132PM焦磷酸根置换到丫，（3-32PATP所需酶时，1个Weiss单位相当于个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970）或者60个粘端单位（如NewEnglandBiolabs公司所定义）。因此，Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16c下30分钟内可使50%的入口1菌体Hindin片段（5wg）得以连接。在本书中，T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。par目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1-5单位/“），可用20mmol/L、60mmol/LKCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500g/ml牛血清白蛋白、50%甘

15、稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20C保存3个月可保持稳定。3）每个样品各取12区l转化大肠杆菌。（三）平端DNA连接T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978）,由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1）低浓度（L）的ATP（Ferretti和Sgaranekka,1981）。2）不存

16、在亚精胺一类的多胺。3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位.ml）。4）高浓度的平端。1.凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanTHarrison,1985）或氯化六氨全高钻（Rusche和Howard-Flanders,1985），可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1 ）它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。2）它

17、们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。par在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。（1）聚乙二醇（PEG80001）用去离子水配制的PEG8000贮存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显着。除PEG800和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0C混合，然后加适当体积的PEG8000（处于室温），混匀，加酶后于20c进

18、行温育。2 ）连接混合物中含LATP和5mmol/LMgCl2时对连接反应的刺激效应最为显着，甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983。3）浓度为15%的PEG8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。4)PEG8000可刺激短至8个核甘酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面,它与氯化六氨合高钻有所不同。(2)氯化六氨合高钻1)氯化六氨合高钻可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20C,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为时，其刺激

19、作用最大。氯化六氨合高钻可使平端连接的效率大约提高到原来的50W,但只能使端连接的效率提高到原来的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。2)在单价阳离子(30mmol/LKCl)存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。3)与PEG8000不同，氯化六氨合高钻不能显着提高合成寡核甘酸的连接速率。一、转化由于外源DNA勺进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNAf无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。但DNAa入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA称为，再与外源DN底触，就能提高转化效率