第十章原生物基因表达的调控ppt课件

1、第十章第十章 原核生物基因原核生物基因 表达的调控表达的调控n生物的遗传信息是以基因的形式储藏在细生物的遗传信息是以基因的形式储藏在细胞内的胞内的DNA(或或RNA)分子中的。随着个体分子中的。随着个体的发育，的发育，DNA有序地将遗传信息，通过转有序地将遗传信息，通过转录和翻译的过程转变成蛋白质，执行各种录和翻译的过程转变成蛋白质，执行各种生理生化功能，完成生命的全过程。从生理生化功能，完成生命的全过程。从DNA到蛋白质的过程，叫做基因表达到蛋白质的过程，叫做基因表达(gene expression)，对这个过程的调节，对这个过程的调节就称为基因表达调控就称为基因表达调控(gene regu

2、lation或或gene control)。n基因调控是现阶段分子生物学研基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。要了解生物生长究的中心课题。要了解生物生长发育的规律、形态结构特征和生发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念。达调控的时间和空间概念。基因表达调控在两个水平上体现基因表达调控在两个水平上体现 (1)转录水平上的调控转录水平上的调控(transcriptional regulation); (2)转录后水平上的调控转录后水平上的调控(post-transcriptional regulation)，包括，包括mRN

3、A加工成熟水平上的调加工成熟水平上的调控控(differential processing of RNA transcript);翻译水平上的调控翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。 无论原核还是真核生物，其基因调控主要发生无论原核还是真核生物，其基因调控主要发生在转录水平上，包括在转录的起始阶段和终止阶段。在转录水平上，包括在转录的起始阶段和终止阶段。 n对于原核生物，以营养状况对于原核生物，以营养状况(nutritional status)和环境因素和环境因素(environmental factor)为主要的基为主要的基因表达影响因素。在

4、真核生物尤其是高等真核生因表达影响因素。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平物中，激素水平(hormone level)和发育阶段和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主是基因表达调控的最主要手段，而营养和环境因素的影响力大为下降。要手段，而营养和环境因素的影响力大为下降。n在转录水平上对基因表达调控取决于在转录水平上对基因表达调控取决于DNA的结构、的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。的相互作用。基基 本本 概概 念念 操纵子操纵子operon） 很多功能上相关的结构基因在染色体上串连很多功

5、能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由排列，由 一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包含这些结构含这些结构 基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子(operon)。 一个完整的操纵子主要包括启动子、操纵基一个完整的操纵子主要包括启动子、操纵基因、构造因、构造 基因和终止子。基因和终止子。 2. 阻遏物和激活物阻遏物和激活物reperssor and activator）结构基因：编码蛋白质或结构基因：编码蛋白质或RNA的基因。的基因。调节基因：参与其它基因表达调控的调节基因：参与其它基因表达调控的RNA和蛋白

6、和蛋白质的编码基因。其编码的调节蛋白称为阻遏物或激质的编码基因。其编码的调节蛋白称为阻遏物或激活物。活物。调节蛋白具有与其它调节蛋白具有与其它DNA结合蛋白类似的结构特结合蛋白类似的结构特征：螺旋征：螺旋-转角转角-螺旋螺旋helix-turn-helix，HTH）。）。两个螺旋分别由两个螺旋分别由7-9个氨基酸残基构成，其间间隔个氨基酸残基构成，其间间隔4个氨基酸残基。两个螺旋之间约为直角，螺旋个氨基酸残基。两个螺旋之间约为直角，螺旋2嵌入嵌入DNA双螺旋大沟内，负责与双螺旋大沟内，负责与DNA的特异性结的特异性结合，称为合，称为“识别螺旋识别螺旋”；螺旋；螺旋1中的氨基酸与中的氨基酸与DN

7、A的磷酸戊糖骨架非特异性结合，基本上平行于双螺的磷酸戊糖骨架非特异性结合，基本上平行于双螺旋。旋。C蛋白蛋白的的N端含端含有有5个个螺旋螺旋,第第2和第和第3个个螺旋形螺旋形成成HTH(螺螺旋旋-转角转角-螺旋螺旋)3. 负调控和正调控负调控和正调控negative and positive regulation）调节蛋白与调节蛋白与DNA特定位点的相互作用，启动或增强特定位点的相互作用，启动或增强操纵子的转录活性，这种调控方式叫做正调控，如激操纵子的转录活性，这种调控方式叫做正调控，如激活物参与的调控。活物参与的调控。调节蛋白与调节蛋白与DNA特定位点的相互作用，关闭或降低特定位点的相互作用

8、，关闭或降低操纵子的转录活性，这种调控方式叫做负调控，如阻操纵子的转录活性，这种调控方式叫做负调控，如阻遏物参与的调控。遏物参与的调控。4. 诱导物和共阻遏物诱导物和共阻遏物inducer and corepressor）效应物效应物effector）：能与调节蛋白结合并改变其性）：能与调节蛋白结合并改变其性质的小分子化合物。质的小分子化合物。诱导物：与调节蛋白结合后启动操纵子转录的效应物。诱导物：与调节蛋白结合后启动操纵子转录的效应物。共阻遏物：与调节蛋白结合后关闭操纵子转录的效应共阻遏物：与调节蛋白结合后关闭操纵子转录的效应物。物。第一节第一节 转录水平的调控转录水平的调控一、转录的起始一

9、、转录的起始 转录是原核生物基因表达的主要调控点，转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：主要涉及两个方面：1、RNA合成的酶系；合成的酶系；2、RNA合成起始和终止信号，即合成起始和终止信号，即DNA分分子上的特定序列。子上的特定序列。 通过通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生理状态和环境的变化。从而实现细胞生理状态和环境的变化。1. RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase)： 大肠杆菌的大肠杆菌的RNA聚合酶：由聚合酶：由5个亚基组成，个亚基组成，即即

10、2，有时还有，有时还有2个个 亚基。以亚基。以2组组成的酶称全酶。成的酶称全酶。 亚基与其他亚基结合较松弛，亚基与其他亚基结合较松弛，易从全酶上解离；其余部分易从全酶上解离；其余部分2称为核心酶称为核心酶(core enzyme)。n在大肠杆菌中还发现一种新的在大肠杆菌中还发现一种新的因子，称为因子，称为因子，因因子，因此将含有此将含有亚基的全酶称为全酶亚基的全酶称为全酶I，含有，含有亚基的称为亚基的称为全酶全酶。二者的不同在于：全酶。二者的不同在于：全酶可以利用双链可以利用双链DNA为模板合成为模板合成po1yA)。 n亚基作用：参与启动子的识别和结合以及转录起始复亚基作用：参与启动子的识别

11、和结合以及转录起始复合物的异构化。细胞内哪条合物的异构化。细胞内哪条DNA链被转录、转录方向链被转录、转录方向与转录起点的选择都与与转录起点的选择都与亚基有关。亚基有关。n离体实验表明：全酶所转录的离体实验表明：全酶所转录的RNA和细胞内所转录出和细胞内所转录出的的RNA，其起始点相同，序列相同，若仅用核心酶进，其起始点相同，序列相同，若仅用核心酶进行转录，则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性，行转录，则模扳链和起始点的选择都有很大的随意性，而且往往同一段而且往往同一段DNA的两条链都被转录。的两条链都被转录。n由此可见：由此可见：亚基对识别亚基对识别DNA链上的转录信号是不可链上的转录信号

12、是不可缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。缺少的，它是核心酶和启动子之间的桥梁。 因子的因子的取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。取代在细胞发育和对环境应答的反应中起主导作用。2. 启动子启动子 (promotor)： 转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子就是转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子就是连接在基因连接在基因5端上游的端上游的DNA序列，其长度从序列，其长度从100 bp到到200 bp不等，是转录起始时不等，是转录起始时RNA聚聚合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被转录。此外，启动子还包括与调节蛋白结合的转录。此外，启动子

13、还包括与调节蛋白结合的位点。位点。在启动子与终止子之间是一个转录单位，通常将在启动子与终止子之间是一个转录单位，通常将mRNA开始的一个核苷酸定为起点开始的一个核苷酸定为起点(即即+1)由由此向右常称为下游此向右常称为下游(downstream)，其核苷酸，其核苷酸依次编为正序号；起始点左例称为上游依次编为正序号；起始点左例称为上游(upstream)其核苷酸则依次以负号表示紧其核苷酸则依次以负号表示紧接起始点左侧的核昔酸为接起始点左侧的核昔酸为-1。u启动子区的上游激活序列和操纵基因启动子区的上游激活序列和操纵基因u启动子区中与正调节蛋白结合的位点，叫做上游激启动子区中与正调节蛋白结合的位点

14、，叫做上游激活序列活序列upstream activating sequence，UAS），），一般位于一般位于-35区上游；与负调节蛋白结合的位点称操区上游；与负调节蛋白结合的位点称操纵基因纵基因operator），一般与启动子重叠。），一般与启动子重叠。 u具有具有UAS序列的启动子，一般没有典型的序列的启动子，一般没有典型的-35区，区，因此因此RNA聚合酶不能很好地与之结合。只有当激活蛋聚合酶不能很好地与之结合。只有当激活蛋白结合在白结合在UAS上后，通过与上后，通过与RNA聚合酶在空间上相互聚合酶在空间上相互作用或改变启动子区中与作用或改变启动子区中与RNA聚合酶结合部位的聚合酶结合

15、部位的DNA的构型，从而提高启动子的活性。如大肠杆菌中依赖的构型，从而提高启动子的活性。如大肠杆菌中依赖cAMP-CAP激活的乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等操纵子。激活的乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等操纵子。有时，一个基因或操纵子需要有时，一个基因或操纵子需要2个相互分开的操纵个相互分开的操纵基因，一个位于转录起点附近，另一个在距离启动子基因，一个位于转录起点附近，另一个在距离启动子区约几百区约几百bp的上游或下游。其中每个操纵基因都与的上游或下游。其中每个操纵基因都与一个阻遏物结合，然后两个阻遏物在空间上相互作用，一个阻遏物结合，然后两个阻遏物在空间上相互作用，形成一个形成一个DNA环，从而抑制环，从而

16、抑制RNA聚合酶与启动子的聚合酶与启动子的结合。结合。二、二、因子与转录起始调控因子与转录起始调控- 因子的替代可以控制起因子的替代可以控制起始始1. 1. 在在E.coliE.coli，不同类型的启动子需要不同类型的，不同类型的启动子需要不同类型的因子因子n在正常的温度和环境下，大肠杆菌主要依靠在正常的温度和环境下，大肠杆菌主要依靠70 进进行基因的转录。行基因的转录。n当环境温度升高时，许多原核和真核生物都会产生热当环境温度升高时，许多原核和真核生物都会产生热激状态，正常表达的基因会关闭或表达水平下降，而激状态，正常表达的基因会关闭或表达水平下降，而编码热激蛋白编码热激蛋白heat sho

17、ck protein的基因开始表的基因开始表达，这些蛋白质能提高菌体对高温的抵抗力，此即谓达，这些蛋白质能提高菌体对高温的抵抗力，此即谓热激反应。热激反应。n在大肠杆菌中，编码热激蛋白的基因有在大肠杆菌中，编码热激蛋白的基因有30多种，其多种，其中绝大多数热激基因的启动子是中绝大多数热激基因的启动子是32。2. 枯草芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌中亚基的更替与生活周期的转变亚基的更替与生活周期的转变u目前已从枯草芽孢杆菌中发现至少目前已从枯草芽孢杆菌中发现至少10种种因子，因子，其中正常生活的其中正常生活的RNA聚合酶的聚合酶的因子为因子为43，识别，识别与与70 相同的启动子保守序列。相同的启动子保

18、守序列。u大部分大部分因子转换的例子都发生在孢子形成因子转换的例子都发生在孢子形成sporulation中。中。u 孢子形成分为三个阶段孢子形成分为三个阶段u （1DNA复制；复制；u （2在细胞的一端基因组被分离；在细胞的一端基因组被分离；u （3分离的基因组外包上一层子外壳。分离的基因组外包上一层子外壳。芽孢的形成芽孢的形成轴丝形成轴丝形成形成隔膜形成隔膜形成前芽孢形成前芽孢孢子囊破裂，孢子囊破裂，芽孢释放芽孢释放芽孢成熟芽孢成熟形成孢子衣形成孢子衣芽孢外壳）芽孢外壳）形成皮层形成皮层 前孢子 母细胞 43 H 磷酸化激活了 全酶含有43 F和proE 和H 的合成 F pro-E F 取

19、代了核 心酶上的43 F-核心酶复合 E被活化并取 体转录孢子形成 代了43 的早期基因 G 早期基因产 产生了K基因 生了G E转录K基因 K G被活化并取代 K被激活并 了F 取代了E 活化的G负责 活化的K负责 转录晚期基因 转录晚期基因 图16-34 孢子形成涉及到因子的改变，从尔控制RNA Pol 起始转录的特异性 (仿B.Lewin:GENES,1997, Fig .11.24) F 对对 E的活性控制的活性控制n在前孢子中由早期基因产生在前孢子中由早期基因产生G, G使使RNA聚合酶在前孢子中转录晚期孢子形成基因。聚合酶在前孢子中转录晚期孢子形成基因。n另一个早期孢子形成基因产物

20、负责和母细胞另一个早期孢子形成基因产物负责和母细胞中的成分联系，中的成分联系，F激活激活SpoR，SpoR由由前孢子分泌，然后它激活膜结合蛋白前孢子分泌，然后它激活膜结合蛋白SpoGA。 n活化的活化的SpoGA在母细胞中剪切失活的前体在母细胞中剪切失活的前体物物Pro- E使其成为活化因子使其成为活化因子E。四种四种sigma 因子的活化调节因子的活化调节三、转录的终止和抗终止三、转录的终止和抗终止1. 终止子的结构终止子的结构 DNA上提供转录停止信号的一段序列称为上提供转录停止信号的一段序列称为终止子终止子(terminator)，是一个基因的末端或是，是一个基因的末端或是一个操纵子的末

21、端的一段特定序列。与启动子一个操纵子的末端的一段特定序列。与启动子不同，终止子能被转录成不同，终止子能被转录成mRNA。类型：强终止子和弱终止子类型：强终止子和弱终止子强终止子：不依赖于强终止子：不依赖于Rho蛋白质辅助因子而能蛋白质辅助因子而能实现终止作用，这类终止子属于强终止子；实现终止作用，这类终止子属于强终止子；弱终止子：依赖于弱终止子：依赖于Rho因子才能实现终止作用，因子才能实现终止作用，这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称这类终止子属于弱终止子。蛋白质辅助因子称为释放因子，通常称为为释放因子，通常称为因子。因子。n所有原核生物的终止子共同的序列特征：即在转录终止点之所有原核生

22、物的终止子共同的序列特征：即在转录终止点之前有一段回文结构，因而所产生的前有一段回文结构，因而所产生的mRNA可形成茎环状的发可形成茎环状的发夹结构，它可使夹结构，它可使RNA聚合酶的移动停止或减缓。聚合酶的移动停止或减缓。n强终止子回文结构中富含强终止子回文结构中富含GC对，在回文序列的下游常有对，在回文序列的下游常有68个个A，因此这段终止子转录后形成的，因此这段终止子转录后形成的RNA具有与具有与A相对应的相对应的寡聚寡聚U，是使，是使RNA聚合酶脱离模板的信号。聚合酶脱离模板的信号。n依赖于依赖于因子的终止子其回文序列中因子的终止子其回文序列中GC对含量较少，回文序对含量较少，回文序列

23、下方没有固定结构，其列下方没有固定结构，其AU对含量也较低；由于其茎环结对含量也较低；由于其茎环结构常较短，在没有构常较短，在没有因子时这种茎环结构不稳定。如果没有因子时这种茎环结构不稳定。如果没有因子存在，因子存在，RNA聚合酶会继续转录下去，产生通读聚合酶会继续转录下去，产生通读(read through)，当，当因子存在时，转录才能终止。因子存在时，转录才能终止。u在强终止子中，转录的在强终止子中，转录的RNA在终止子部位形成的发在终止子部位形成的发夹结构破坏了转录泡中夹结构破坏了转录泡中RNA-DNA杂合链的形成，而杂合链的形成，而RNA-DNA杂合链能帮助杂合链能帮助RNA聚合酶固定

24、在聚合酶固定在DNA链上，链上，因此转录泡中的因此转录泡中的RNA-RNA发夹结构使发夹结构使RNA聚合酶变聚合酶变得不稳定，结果得不稳定，结果RNA聚合酶和聚合酶和RNA都从都从DNA链上脱离，链上脱离，转录终止。转录终止。u因子辅助的终止作用因子辅助的终止作用 因子结合于正在合成的因子结合于正在合成的RNA的的rutrho utilization site位点如果位点如果rut位点被核位点被核糖体翻译，则糖体翻译，则因子不能与之结合），利用其依赖于因子不能与之结合），利用其依赖于RNA的的ATP酶活性水解酶活性水解ATP获得能量沿获得能量沿RNA按按5-3方向移动；方向移动；当当RNA聚合

25、酶遇到终止子而暂停转录时，聚合酶遇到终止子而暂停转录时， 因子得以在因子得以在终止子处追上终止子处追上RNA聚合酶并进入转录泡的聚合酶并进入转录泡的RNA-DNA杂合杂合链中；其链中；其RNA-DNA解旋酶活性使杂合双链解旋，释放解旋酶活性使杂合双链解旋，释放RNA聚合酶，转录终止。聚合酶，转录终止。2. 基因表达的极性效应基因表达的极性效应在正常情况下原核基因表达时，其转录出来的在正常情况下原核基因表达时，其转录出来的mRNA随随即进行翻译，这时整个即进行翻译，这时整个mRNA都覆盖着核糖体，都覆盖着核糖体， 因子无因子无法接近法接近mRNA，而，而RNA聚合酶早已越过前面的基因的依聚合酶早

26、已越过前面的基因的依赖赖因子的终止子，所以转录实际上并不停止，而是继续因子的终止子，所以转录实际上并不停止，而是继续转录后续基因。如果在某一基因的依赖于转录后续基因。如果在某一基因的依赖于的终止子之前的终止子之前发生无义突变，核糖体便从无义密码子上解离下来，翻译发生无义突变，核糖体便从无义密码子上解离下来，翻译停止，于是停止，于是就可以自由进入就可以自由进入RNA并移动，直到赶上停留并移动，直到赶上停留在终止子上的在终止子上的RNA聚合酶，结果使聚合酶，结果使RNA聚合酶释放，不聚合酶释放，不能再转录下游基因。能再转录下游基因。基因表达的极性现象：在某些情况下同一转录单元里，由基因表达的极性现

27、象：在某些情况下同一转录单元里，由于一个基因的无义突变，阻碍了下游相邻基因表达的效应，于一个基因的无义突变，阻碍了下游相邻基因表达的效应，就称为基因表达的极性现象。就称为基因表达的极性现象。除了无义突变可以导致极性现象外，插入序列除了无义突变可以导致极性现象外，插入序列IS1、IS2等等DNA片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象。片段插入到操纵子的基因中也会发生极性现象。3. 抗终止作用抗终止作用anti-termination） 因子的作用可以被抗终止因子所抵消，这样，因子的作用可以被抗终止因子所抵消，这样，RNA聚合酶便可通过终止子聚合酶便可通过终止子(依赖于依赖于因子的因子的)继续继

28、续转录后面的基因，这种现象称为抗终止作用转录后面的基因，这种现象称为抗终止作用(anti-termination)。第二节第二节 操纵子类型操纵子类型l可诱导负控制系统可诱导负控制系统l可诱导正控制系统可诱导正控制系统l可阻遏负控制系统可阻遏负控制系统l可阻遏正控制系统可阻遏正控制系统操纵子调控系统的基本类型操纵子调控系统的基本类型 负调控 正调控 Lac O Ara O 诱 导 失活的阻遏物 活化的激活蛋白 阻遏物 诱导物 失活的活性蛋白 诱导物 阻遏 诱导 阻遏 诱导 Trp O 阻 遏 失活的活性蛋白 辅-阻遏物 活化的激活蛋白 辅-阻遏物 失活的活性蛋白 诱导 阻遏 诱导 阻遏 图 1

29、6-1 原核生物结构基因的 4 种表达调控类型 (仿 B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.21) 原原核核生生物物结结构构基基因因表表达达的的4种种调调控控类类型型一、大肠杆菌乳糖操纵子一、大肠杆菌乳糖操纵子1大肠杆菌的乳糖利用系统大肠杆菌的乳糖利用系统 大肠杆菌的乳糖代谢需要有大肠杆菌的乳糖代谢需要有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-galactosidase的催化，这种酶能把乳糖水解为半乳糖的催化，这种酶能把乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，或转化为异乳糖作为诱导物和葡萄糖，或转化为异乳糖作为诱导物 。另外有。另外有-半乳半乳糖苷透性酶和糖苷透性酶和-半乳糖苷转乙酰酶，前者协助乳糖分子半

30、乳糖苷转乙酰酶，前者协助乳糖分子穿膜进入细胞内，后者可将乙酰基从乙酰辅酶穿膜进入细胞内，后者可将乙酰基从乙酰辅酶A上转移至上转移至-半乳糖苷上。三种酶协同作用，使得乳糖得以分解和半乳糖苷上。三种酶协同作用，使得乳糖得以分解和利用。利用。 乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控 H OH HO H OH H H CH2OH H O OH HO O H O CH2 CH2OH H OH OH H HO O H 别乳糖 H O OH H H H OH OH H H H2O H H H O OH CH2OH CH2OH H OH CH2OH H O OH HO O OH H H OH H OH H HO

31、 H H H H OH H OH 葡萄糖 半乳糖 图 16- 乳糖分解的不同产物-半乳糖苷酶催化乳糖的两种反应半乳糖苷酶催化乳糖的两种反应诱导物诱导物的加入的加入和去除和去除对对lac mRNA及及LacZ合成合成的影响的影响项目项目功能功能结构结构基因基因3个不同结构基因能够产生个不同结构基因能够产生3种不同的酶。种不同的酶。（lacZ、Y、A）操纵操纵基因基因（O）是结构基因的开关是结构基因的开关.通过对通过对RNA聚合酶阻聚合酶阻抑与否来控制结构基因的转录或停止。抑与否来控制结构基因的转录或停止。启动启动子（子（P）是是RNA聚合酶与聚合酶与DNA结合的部位，可识结合的部位，可识别转录起

32、始点。别转录起始点。调节调节基因基因（I）有自己独立的转录单位，能产生阻遏蛋有自己独立的转录单位，能产生阻遏蛋白，通过与操纵基因的结合与否来控制白，通过与操纵基因的结合与否来控制操纵基因的关闭和开启。操纵基因的关闭和开启。乳糖操纵子的结构和功能乳糖操纵子的结构和功能2乳糖操纵子的负调控可诱导）乳糖操纵子的负调控可诱导）诱导因子：异乳糖、诱导因子：异乳糖、-半乳糖苷、异丙基半乳糖苷、异丙基-D-硫代硫代 半乳糖苷半乳糖苷IPDG）。）。机制：没有诱导物时，具有活性的阻遏物和操纵基因机制：没有诱导物时，具有活性的阻遏物和操纵基因结合，转录不能进行。有诱导物时，乳糖与阻遏物结结合，转录不能进行。有诱

33、导物时，乳糖与阻遏物结合，使阻遏物发生构象变化而失活，不能与操纵子结合，使阻遏物发生构象变化而失活，不能与操纵子结合，结构基因正常转录，进而再翻译出蛋白质。合，结构基因正常转录，进而再翻译出蛋白质。 CH2O H CH3 H O O S C CH3 H CH3 O H HH H H O H图16-6 异 丙 基 - -硫 代 半 乳 糖 苷 的 分 子 结 构IPTG：有极强的诱导效应，本身又不被分解，称为非底物诱导：有极强的诱导效应，本身又不被分解，称为非底物诱导 未 诱 导 ： 结 构 基 因 被 阻 遏 阻 遏 物 四 聚 体 L acI P O lacZ lacY lacA 图 16-

34、 当 无 诱 导 物 时 阻 遏 物 结 合 在 操 纵 基 因 上 转录起始点 DNA 解链区 50 40 30 20 10 1 10 20 30 RNA 聚合酶结合的起动子区 阻遏物结 合的操纵基因区 图 16-4 在 lac 操纵子上阻遏物结合区和 RNA 聚合酶结合区的重叠 诱导：基因被打开 -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰转移酶 图16-7 诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关 诱导诱导物和物和阻遏阻遏蛋白蛋白结合结合的模的模型型 维 持 阻 遏 过 量 的 阻 遏 物 可 结 合 在D N A 阻 遏 物 结 合 在 的 其 它 位 点 操 纵 基 因 上 aaaa aaa a a 诱 导

35、 物 a 诱 导 所 有 的 阻 遏 物 都 结 合 a a 在D N A的 随 机 位 点 上 a a a aa 诱 导 物 解 离 a 建 立 阻 遏 阻 遏 物 恢 复 活 性 状 态 a a a 阻 遏 蛋 白 通 过 直 接 取 代 a 从 随 机 位 点 移 向 a 操 纵 基 因 a a a a a a 图16-14 在 细 胞 中 所 有 的 阻 遏 蛋 白 都 结 合 在D N A上 (仿B .L ew in: G E N E S ,1997, Fig .12.18) 3乳糖代谢的突变型乳糖代谢的突变型n1961年年 Jacob & Monod等通过对突变体的研究，证

36、明了等通过对突变体的研究，证明了调节基因和操纵基因的存在。调节基因和操纵基因的存在。n通过构建部分二倍体，如：通过构建部分二倍体，如：n FlacI-lacZ+Y-A+ X F-lacI+lacZ-Y+A-nlacI-lacZ+Y-A+/lacI+lacZ-Y+A-，发现了以下突变：，发现了以下突变：nlacI S 阻遏蛋白不可诱导性突变，阻遏蛋白失去诱导物结阻遏蛋白不可诱导性突变，阻遏蛋白失去诱导物结合位点，始终作用于结构基因，为超阻遏突变型。合位点，始终作用于结构基因，为超阻遏突变型。nlacI - 阻遏蛋白不能形成寡聚物，对阻遏蛋白不能形成寡聚物，对lacI+ 隐性。隐性。nlacI -

37、d 阻遏蛋白不能和阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补结合，且呈负互补(反式显性反式显性)nO c 操纵基因的组成型突变，只对同一染色体上的结构操纵基因的组成型突变，只对同一染色体上的结构基因起作用，为顺式显性。基因起作用，为顺式显性。 Active repressor cannot bind to O c mutant operantor Operon is transcribed and translated lacI O c operantor -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰转移酶 图16-7 操纵基因发生组成型突变，操纵子组成型表达 Inactive repressor lacIgenes

38、ythesizes defective repressor that does not bind to DNA LacI + gene sythesizes lacI Operator wild-type repressor which bind to operator lacI + Inducer displaces wild-type repressor from operator as usual 图图 16- Constitutive mutations in the lacI gene are recessive. Repressor has lost lacI S genesyth

39、esizes Iducer-binding site defective repressor that cannot bind inducer; it binds permanently to operator lacI S Operantor lacI + wild-type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 图图 16- Uninducible lac S mutations are dominant 表 16-1在单倍体和部分二倍体中-半乳糖苷酶透过酶的合成基因型-半乳糖苷酶透过酶不诱导诱导不诱导诱导 I

40、 +Z +Y + I Z +Y +I +Z Y + / FI Z +Y +I Z Y + / FI +Z +Y +I Z Y + / FI Z +Y -(I,Z,Y)/ FI Z +Y +O +Z +Y +O +Z +Y + / FO +Z Y +O cZ +Y +O +Z +Y- / FO cZ +Y +O +Z +Y + / FO cZ Y +O +Z Y + / FO cZ +Y -I sO +Z +Y +/FO cZ +Y +:表示缺失， “”表示酶以最高水平存在， “”表示酶以最低水平存在 关于关于lacI -du阻遏蛋白上具有两种不同类型的结合位点：阻遏蛋白上具有两种不同类型的结合

41、位点：DNA-结合位点识别结合位点识别操纵基因，诱导物结合位点与小分子诱导物结合。一旦与诱导物操纵基因，诱导物结合位点与小分子诱导物结合。一旦与诱导物作用使其构象发生改变而失去与操纵基因作用使其构象发生改变而失去与操纵基因DNA结合的能力。结合的能力。DNA-结合位点的突变是组成型的因为阻遏物不能和结合位点的突变是组成型的因为阻遏物不能和DNA结合结合来阻断转录）。诱导物结合位点的突变是不可诱导性的由于诱来阻断转录）。诱导物结合位点的突变是不可诱导性的由于诱导物不能减少阻遏物和导物不能减少阻遏物和DNA的亲和力）。的亲和力）。u阻遏物功能的一个重要的特点是形成多聚体蛋白。在细胞中阻阻遏物功能的

42、一个重要的特点是形成多聚体蛋白。在细胞中阻遏蛋白的亚基随机结合成四聚体。当不同的遏蛋白的亚基随机结合成四聚体。当不同的lacI 等位基因存在时，等位基因存在时，它们的产物作为亚基结合成异聚四聚体，其特性和同聚四聚体不它们的产物作为亚基结合成异聚四聚体，其特性和同聚四聚体不同。这种亚基之间的作用类型具有多聚体蛋白的性质，被称为等同。这种亚基之间的作用类型具有多聚体蛋白的性质，被称为等位基因间的互补位基因间的互补interallelic complementation）。）。 Helix-turn-helix Core domain1 Core domain2 1 51 80 360 DNA bi

43、nding Hinge Inducer binding Oligomerization 图16- 阻遏蛋白单体的结构和功能阻遏蛋白的结构：阻遏蛋白的结构：N端：端：159aa，头部片段，为，头部片段，为HTH，与操纵基因，与操纵基因DNA大大沟结合；沟结合；核心区：有核心区：有6个个折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中；裂缝中；C端：为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。端：为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。阻遏蛋白单体的三级结构u负的互补负的互补negative complementation）：此）：此lacI-d的突变的突变导致阻遏蛋白不能和操纵基因结合。因

44、此它像导致阻遏蛋白不能和操纵基因结合。因此它像lacI - 等位基因一等位基因一样，使操纵子呈组成型表达。由于样，使操纵子呈组成型表达。由于lacI- 类型的突变产生的阻遏物类型的突变产生的阻遏物没有活性，它相对于野生型基因是隐性的，而没有活性，它相对于野生型基因是隐性的，而“-d这个符号表这个符号表示负互补这种突变类型是显性的。这种突变称反式显性示负互补这种突变类型是显性的。这种突变称反式显性trans-dominant），也称为显性失活），也称为显性失活dominant negatives）。）。u这种显性的原因是由于这种显性的原因是由于lacI-d等位基因产生一个等位基因产生一个“坏的亚

45、基，坏的亚基，减少了与减少了与DNA结合位点的数目，使四聚体和操纵基因的亲和力减结合位点的数目，使四聚体和操纵基因的亲和力减少。不仅它本身不能结合操纵基因的少。不仅它本身不能结合操纵基因的DNA，而且它还通过作为四，而且它还通过作为四聚体的一部分阻止四聚体中聚体的一部分阻止四聚体中“好的亚基与好的亚基与DNA结合。这就意味结合。这就意味着阻遏蛋白四聚体是作为一个总体，而不是单个单体的简单的集着阻遏蛋白四聚体是作为一个总体，而不是单个单体的简单的集合，这对完成阻遏来说是很必要的。在体外将合，这对完成阻遏来说是很必要的。在体外将“好的亚基和好的亚基和“坏的亚基混合起来也会产生破坏作用。坏的亚基混合

46、起来也会产生破坏作用。2.乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控1cAMP-CAP的正调控作用的正调控作用cAMP由腺苷环化酶由腺苷环化酶adenylate cyclase催化合成。催化合成。CAPcatabolite activator protein，分解代谢物激活蛋，分解代谢物激活蛋白白22.5kD，是原核生物基因表达的一种正调节蛋白。，是原核生物基因表达的一种正调节蛋白。cAMP-CAP以两种方法来激活转录：以两种方法来激活转录： （1它可能直接和它可能直接和RNA Pol相互作用；相互作用； （2） 作用于作用于DNA，改变其结构，从而帮助，改变其结构，从而帮助RNA Pol结合。结合

47、。CAP-I：-70-50；CAP-II：-50-40P: -82+1O: -7+28 转录起点 gal lac ara 启动子 CAP结合位点 操纵基因 图16-20 CAP蛋白可结合于相对于启动子的不同位点 (仿B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.25) cAMP-CAP可结合于相对于启动子的不同位点可结合于相对于启动子的不同位点2分解代谢产物阻遏作用分解代谢产物阻遏作用当培养基中有葡萄糖存在时，即使有乳糖存在，也不诱当培养基中有葡萄糖存在时，即使有乳糖存在，也不诱导靶基因表达。这种现象称为葡萄糖效应或分解代谢产导靶基因表达。这种现象称为葡萄糖效应或分解代谢产物阻遏，这

48、样的操纵子称葡萄糖敏感操纵子。物阻遏，这样的操纵子称葡萄糖敏感操纵子。葡萄糖抑制操纵子的原理：葡萄糖抑制操纵子的原理：cAMP-CAP复合物的形成取复合物的形成取决于决于AMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为不能转化为cAMP， cAMP浓浓度下降，不能形成度下降，不能形成cAMP-CAP复合物，复合物，RNA聚合酶无聚合酶无法结合在法结合在DNA上，结构基因不表达。上，结构基因不表达。3代谢物阻遏与诱导的关系代谢物阻遏与诱导的关系受受CAP调控的操纵子，其转录必须满足调控的操纵子，其转录必须满

49、足2个条件：个条件：培养基中缺少葡萄糖；培养基中缺少葡萄糖；有操纵子的诱导物存在。有操纵子的诱导物存在。乳糖操纵子：两个开关乳糖操纵子：两个开关 第一：第一：cAMP -CAP复合物复合物 受葡萄糖影响受葡萄糖影响 第二：异乳糖复合物第二：异乳糖复合物受乳糖影响受乳糖影响二、半乳糖操纵子二、半乳糖操纵子(galactose operon)大肠杆菌半乳糖操纵子包括大肠杆菌半乳糖操纵子包括3个结构基因：个结构基因： 异构酶异构酶(UDP-galactose-epimerase, galE)半乳糖半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT

50、)半乳糖激酶半乳糖激酶(galactose kinase, galK)这这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。磷酸。因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，在时，gal 操纵子仍可被诱导。操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类gal 结构结构基因高效表达）；基因高

51、效表达）；而另一类突变株中而另一类突变株中gal 基因的表达完全依赖于葡萄糖，基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal 基因不表达，基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。不合成半乳糖代谢酶类。n分析分析gal 操纵子操纵子P-O区的区的DNA序列发现，该操纵子确实存序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始的启动子，可以分别起始mRNA的合成。的合成。每个启动子拥有各自的每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点S1和和S2。n从从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进起始的转录

52、只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，行，RNA聚合酶与聚合酶与S1的结合需要半乳糖、的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度和较高浓度的的cAMP。n从从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，时，转录从转录从S1开始，当无开始，当无cAMP-CAP时，转录从时，转录从S2开始。开始。 结构特点结构特点 (1)双启动子：双启动子：P1依赖于依赖于cAMP-CAP，转录起点为，转录起点为+1，-10顺顺 序位于序位于-12-6，称为，称为-10S1；P2不

53、依赖于不依赖于cAMP-CAP，转，转 录起点为录起点为-5，-10顺序位于顺序位于-17-11，称为，称为-10S2； (2)双操纵基因：双操纵基因：OE 位于位于CAP位点内，位点内，OI 在在galE内部；内部； (3) 无无-35顺序。顺序。 Gal 既可为碳源，同时既可为碳源，同时UDP-Gal又是合成细菌细又是合成细菌细胞壁的重要前体。胞壁的重要前体。 gal E P 1 cA M P-CA P galK TE OI P 2 OE (17 ) galR galU (62 ) (27 ) K T E PO galU galR m R N A G lu-1-P 阻 遏 物 G al激

54、酶 G al转 移 酶 表 面 异 构 酶 尿 苷 转 移 酶 U UD DP P- -G Gl lu u G al G Ga al l- -1 1- -P P U UD DP P- -G Ga al l + + G Ga al l- -1 1- -P P 图16-23 E.coli gal 操 纵 子 的 结 构 ， 在 染 色 体 上 的 分 布 及 其 产 物 gal 操纵子的结构操纵子的结构 AAATTCTTGTGTAAACGATTCCACTAATTTA P1 -17 -11 P2 +CAP galE 起始点 TATGCTA CAP GGAA 76 CAP 位点 47 cAMP-CAP

55、 位点 -10S2 S-D galOI 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 +1 +10 +20 +30 +40 +50 +6010 +1 +10 +20 +30 +40 +50 +60 TTGTGTAAACGATTCCACTAA TATGGTT GalOE 12 (10S1 ) 6 图 16-24 Gal 操纵子具有双启动子(P1，P2 )和双操纵基因 (galOE,galOI )(1) 有有Gal P1启动启动 K,T,E 转录转录 无无 Glc 无无Gal P1不启动不启动 无无Gal OE 与与O I 结合形成环，仅转结

56、合形成环，仅转 有有 录录20bp 有有Gal P2启动启动 S2 转录转录galE，组成型，组成型(2) CAP-cAMP对对P1 正调节，对正调节，对P2 抑制抑制 (3) 阻遏物对阻遏物对P1，P2 都是负调控，都是负调控， CAP-cAMP 含量少时含量少时P2 可转录可转录 (机制不清机制不清)(4)P1与与RNA Pol亲和力亲和力 P2与与RNA Pol亲和力，所亲和力，所以在没有以在没有Glc而有而有Gal存在时，存在时，P1转录，而转录，而P2不转录。不转录。2. 调节调节没有葡萄糖的条件下没有葡萄糖的条件下有有Gal存在时，存在时，gal R位于位于62编码的阻遏物失活，编

57、码的阻遏物失活，CAP结合在结合在-4723区域，区域，RNA Pol结合在结合在-10S1区，区，CAP和和RNA Pol直接相互作用，使直接相互作用，使P1顺利转录；顺利转录；无无Gal时，时，Gal R结合在结合在OE上，上， OE离启动子有一段距离，离启动子有一段距离，当当Gal R结合在结合在OE上时不大可能像上时不大可能像lac操纵子中操纵子中lacI阻遏阻遏那样去阻碍那样去阻碍RNA Pol的结合，它阻断的结合，它阻断S1的转录可能有两的转录可能有两种方式：影响种方式：影响cAMP-CAP和和RNA聚合酶的作用；或通过聚合酶的作用；或通过干扰干扰cAMP-CAP与与DNA的相互作

58、用来阻断。的相互作用来阻断。有葡萄糖存在的情况下，有葡萄糖存在的情况下，cAMP -CAP含量少含量少当当Gal存在时，存在时，P1 不能启动而不能启动而P2 启动，启动，RNA聚合酶结聚合酶结合在合在-10 S2顺序上，顺序上，-10 S2TATGCTA和和-10 S1TATGGTT顺序相似，从顺序相似，从S2开始转录开始转录gal E而不转录而不转录另外的另外的2个基因个基因gal T和和gal K。若无若无Gal存在，存在，Gal R可结合在可结合在OE和和OI上，并使上，并使DNA弯弯曲形成茎环结构。曲形成茎环结构。S2位点阻遏作用和位点阻遏作用和S1的阻遏机制完的阻遏机制完全不同，在

59、上述条件下，即使有全不同，在上述条件下，即使有Gal R存在，存在，P2 仍不受仍不受阻遏开始转录组成型），但由于阻遏开始转录组成型），但由于OI上也有上也有Gal R的结的结合并且成环，故转录只进行合并且成环，故转录只进行20 bp便停止，这个过程如便停止，这个过程如何发生尚不清楚。何发生尚不清楚。为什么为什么gal 操纵子需要两个转录起始位点？操纵子需要两个转录起始位点？n半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质质-尿苷二磷酸半乳糖尿苷二磷酸半乳糖UDPgal是大肠杆菌细胞壁合成的是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半

60、乳糖的情况下，前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差是通过半乳糖差向异构酶的作用由向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产基因的产物。物。n生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。假如生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。假如只有只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CAP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。n假如唯一的启动子是假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，那么，即使在葡萄糖存在