唾液淀粉酶的性质和活力测定

1、唾液淀粉酶的性质和活力测定(-*)1通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶粗反应的影响，pH，底物浓度，温度，激活剂，抑制剂等2学习酶活力，酶活力单位，比活力的测定，加深对概念的理解；3学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，学会用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的含量，熟练操作分光光度计。二.实验试剂和器材器材：可见光分光光度计，试管，移液管，恒温水浴锅，pH试纸，1000ml容量瓶和100ml的容量瓶各一只；药品：可溶性淀粉，考马斯亮蓝试剂G-250,3,5-二硝基水杨酸，NaoH,HCL,标准牛血清白蛋白溶液，醋酸，醋酸钠，蒸镭水，95%乙醇，85%磷,;0.15molNaCL

2、/ml,0.15mol/L硫酸铜溶液，碘化钾-碘溶液：将碘化钾20克和碘10克溶解在100ml水中，使用前稀释10倍。注：(1)考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝试剂G-250100mg溶于95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加水稀释至1000ml,过滤即可。(2)标准牛血清白蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白用凯式定氮法测蛋白含量，根据其纯度用0.15mol/LNacl配置成0.1mg/L的蛋白液；(3)配置0.01%g/ml,0.1%g/ml,0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml的的溶性淀粉溶液；（4）配置一系列pH2的缓冲溶液0.2MOI/L磷酸氢二钠溶液为28.40

3、g/L,Mr=141.98,称取2.84g溶于100ml的水中0.1MOI/L柠檬酸溶液21.01g/l,Mr=210.14,称取2.1溶于100ml水中；锥形瓶号0.2MOI/L磷酸氢二钠（毫升）0.1MOI/L柠檬酸（毫升）缓冲液pH10.419.602.224.1115.893.037.7112.294.0410.309.705.0511.158.855.4612.097.915.8713.226.786.2814.555.456.6916.473.537.01018.171.837.41119.150.857.81219.450.558.05配置0.15mol/L的NaCL溶液和0.1

4、5mol/L硫酸铜溶液三.实验步骤（一）1 pH的对酶的影响1 ）葡萄糖标准曲线的制定准确称取100mgAR纯的葡萄糖，溶于蒸储水中，定容于100ml的容量瓶中，配成1.0mg/L的溶液，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸储水于550nm处测吸光度；试剂处管W01234567葡萄糖标准液/ml0.20.40.60.81.01.21.4蒸储水/ml2.01.81.61.41.21.00.80.63,5-二硝基水杨酸/ml1.51.51.51.51.51.51.51.5入=550nm的吸光值（A）2）取一试管加入2ml淀粉并滴加两滴碘液，加入适量的酶，记录溶液颜色退去的时

5、间，作为接下来各步反应的反应时间t；3）取十二只试管并编号分别加入2ml缓冲液加入2ml,0.1%淀粉，再加入适量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸播水于550nm处测吸光度；4）由pH值和吸光度做曲线，找出最适pH值2温度对酶活性的影响1）取十只试管并编号，分别加入2ml，0.1%淀粉液和相同量的酶同时置于0-100，温度间隔10度，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸储水于550nm处测吸光度；2）由吸光度和温度做曲线，找出最适温度值3底物浓度对酶

6、活性的影响1）取十只试管并编号并编号1-10，由1,2步知最适温度和最适PH调节温度PH值至最合适，然后分别加入0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml淀粉溶液2ml并加入等量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸储水于550nm处测吸光度；2）做吸光度和底物浓度的曲线图，找出最适底物浓度；4激活剂和抑制剂对酶活性的影响取三试管并编号123，分别加入2ml0.1%淀粉溶液，加入最适pH值的缓冲液并在最适温度水浴中保温5min后加入1m稀释的唾液淀粉酶，T时间加入3,

7、5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min,迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸播水于550nm处测吸光度；比较吸光度的大小；（二）酶活力和比活力的测定1）蛋白质标准曲线的制作取十二只试管平行操作试管编号0123450.1mg/l标准蛋白质溶液/ml0.010.030.050.070.09考马斯亮蓝G-250试剂1.001.001.001.001.001.000.15molNaCL/ml0.100.090.070.050.030.01混匀，加以内已。号试管为空白对照，在595nm处比色A2）用标准蛋白质质量为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线3）定义：酶活力单位：每分钟生成1mg葡萄糖所需的酶量4）取一只试管加入一定的酶液（用移液器）加入考马斯亮蓝G-250试剂1.00ml，并和0号管对比，加0.15mol/LnaCL是液面齐平，混匀，1h以内已0号试管为空白对照，在595nm处比色测吸光度；5）根据蛋白质标准曲线求出酶蛋白含量；6）调