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1、本章 内容1.RNA 转录的基本过程 2.转录机器的主要成分3.启动子与转录起始4.原核与真核生物mRNA的特征比较5.终止和抗终止6.内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰第1页/共70页基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。 转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了TU之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。 翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。第2页/共70页 DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的

2、功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。 与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链（coding strand）或称有意义连（sense strand），另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链（template strand）或称反义链（antisense strand）。第3页/共70页DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系。第4页/共70页 DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。 RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核

3、酶直接在细胞内发挥代谢功能。 因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。第5页/共70页生物体内拥有三类RNA 编码特定蛋白质序列的mRNA； 能特异性解读mRNA 中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的 transfer RNA （tRNA）； 直接参与核糖体中蛋白质合成的ribosomal RNA （rRNA）。第6页/共70页3. 1 RNA的转录的基本过程：无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：I.模板识别II.转录起始III.通过启动子转录的延伸IV.转录的终止。第

4、7页/共70页 模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。 转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。I 模板识别第8页/共70页大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示。转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右，被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右。第9页/共70页 真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiatio

5、n transcription complex, PIC），以保证有效地起始转录。第10页/共70页转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。II 转录的起始 (initiation)第11页/共70页 一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。 一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。第12页/共70页 RNA聚合酶离释放因子，核心酶沿DNA链移动并使新生RNA

6、链不断伸长的过程就是转录的延伸。 大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。III 转录的延伸（elongation）第13页/共70页 当RNA链延伸到转录终止位点时 ，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂键。 RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解 DNA恢复成双链状态 RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来 IV 转录的终止 （termination）第14页/共70页37时，转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸，即每秒钟合成1

7、4个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。正常情况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其mRNA的间隔约为2.5分钟，而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。第15页/共70页3. 2 转录机器的主要成分1. RNA聚合酶 RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。第16页/共70页nCapable of polymerization but not initiation（1）RNA polymerase

8、 core enzyme第17页/共70页nCore enzyme + sigma factornThe sigma factor is a separate protein required for initiationnThere are many different sigma factorsnDifferent sigma factors allow for the expression of different genes（2）RNA polymerase holoenzymea a2 2bbbbs sa a2 2bbbb + s sholoenzyme core polymeras

9、e sigma factor第18页/共70页（3）各个亚基的功能 第19页/共70页Phosphodiester bond formationDNA bindingDNA bindingAssemble holoenzyme因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合第20页/共70页The five subunits of the bacterial enzyme are distinguished by color. Only the N-terminal domains of the alpha subunits are included in this model.第21页/共70页 核

10、心酶 （Core Enzyme） 作用于转录的延伸过程（终止） 依靠静电引力与与DNA模板结合模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间） 非专一性的结合（与DNA的序列无关） 结合常数：1011mol第22页/共70页全酶（Holo Enzyme） 用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合 (与核心酶结合后 引起的构象变化) 专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014mol 半衰期：数小时 转录效率低，速度缓慢（ 的结合 ）第23页/共70页 此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能 （1） 因子（sigma factor） 因子可重复使用 修饰R

11、NApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的35区,并通过与模 板链结合2 2 2 2（3）全酶的组装过程第24页/共70页q 因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点，平均结合常数为21011。q因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。q因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1秒。第25页/共70页大肠杆菌中的因子能识别并与启动子区的特异性

12、序列相结合因子基因功能-35区间隔（bp）-10区70rpoD广泛TTGACA16-18TATAAT32rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTA54rpoN氮代谢CTGGNA6TTGCA第26页/共70页 不同的不同的因子识别不同的启动子因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种中有四种因子（因子（70、32、54、28） 枯草杆菌中有枯草杆菌中有6种种因子因子 （因子的更替对转录起始的调控）因子的更替对转录起始的调控）（2）因子 核心酶的组建因子核心酶的组建因子 促使促使RNA聚合酶与聚合酶与DNA模板链结合酶模板链结合酶 2 2 前端前端因子使模板因子使模板D

13、NA双链解链为单链双链解链为单链 尾端尾端因子使解链的单链因子使解链的单链DNA重新聚合为双链重新聚合为双链第27页/共70页 （3） 因子 完成核苷酸底物之间的磷酸酯键的连接完成核苷酸底物之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）功能（排斥与模板链不互补的碱基） 与与Rho （）因子竞争）因子竞争RNA 3end促进促进RNA聚合酶聚合酶NTP RNA elongation 第28页/共70页 （4） 因子因子 参与参与RNA非模板链（非模板链（sense strand）的结合）的结合 （充当（充当SSB） 第29页/共70页由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功

14、能位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点 有义有义DNA链结合位点（链结合位点（ 亚基提供）亚基提供） DNA/RNA杂交链结合位点（杂交链结合位点（亚基提供） 双链双链DNA解链位点（前端解链位点（前端 亚基提供） 单链单链DNA重旋位点（后端重旋位点（后端亚基提供） 因子作用位点第30页/共70页Core Enzyme 具有的四个功能位点 DNA/RNA 杂交位点() D. S.DNA 解链位点() D. S.DNA 重旋() 启动子识别位点 DNA有义链结合位点( ) 第31页/共70页nNo proofreading nuclease activitiesn1 error i

15、n 105 bpnAbout 105 lower than replicationThe fidelity（保真性） of RNA polymerase第32页/共70页 真核生物中的RNA 聚合酶 真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同，对-鹅膏覃碱的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5105第33页/共70页真核生物RNA聚合酶的主要特征 聚合酶中有两个相对分子质量超过1105的大亚基； 同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。

16、第34页/共70页真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较第35页/共70页Ten of the twelve subunits constituting yeast RNA polymerase II are shown in this model. Subunits that are similar in conformation to those in the bacterial enzyme are shown in the same colors. The C-terminal domain of the large s u b u n i t R P B 1 w a s n o t ob

17、served in the crystal structure, but it is known to extend from the position marked with a red arrow.第36页/共70页第37页/共70页All three yeast polymerases havefive core subunits homologous , the two and subunits of E. coli RNA polymerase. The largest subunit (RPB1) of RNA polymerase II also contains an esse

18、ntial C-terminal domain (CTD). RNA polymerases I and III contain the same two nonidentical-like subunits, whereas RNA polymerase II contains two other nonidentical-like subunits. All three polymerases share the same -like subunit and four other common subunits. In addition, each yeast polymerase con

19、tains three to seven unique smaller subunits.第38页/共70页2. 转录复合物 启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物(closed complex)，此时，DNA仍处于双链状态。 然后，封闭复合物转变成开放复合物 (open complex)，聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。对于强启动子来说，从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。第39页/共70页 开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三

20、元复合物。除RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与。第40页/共70页一般情况下，转录起始复合物可以进入两条不同的反应途径1.合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；2.尽快释放亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。第41页/共70页转录延伸复合物较为稳定，可长时间与DNA模板结合而不解离。只有在遇到转录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离，释放转录产物并导致聚合酶本身从模板DNA上脱落。第42页/共70页3.3 启动子与转录的起始启动子(promoter

21、)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。第43页/共70页原核生物的启动子I . 转录起始点转录起始点在多数情况下为嘌呤（90%），常见的序列为CAT， A为转录的起始点。第44页/共70页II. -10序列 （Pribonow Box）-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点,结合位点（B 位点）一致序列：(T80A95T45A60A50T96 ）因此又称TATA Box位置范围 -18 bp 到-9 bp保守保守TTATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开） 第45页/共70页III. -35序列序列 （Sex

22、tama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点 RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点 大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度 位置在不同启动子中略有变动TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号 第46页/共70页IV. -10区和-35区间距离区间距离 在90%的原核生物中为 16到18bp 适宜的距离能为 RNA聚合酶提供合适的空间结构，便于转录的起始。 典型的原核生物的启动子结构为 -35， 1619bp的间隔区， -10区和 转录 起始点， -10区到转录起始点的距离 为 7bp。第47页/共70页大肠

23、杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区第48页/共70页 RNA polymerase scans DNA linearly Slides along DNA without opening strands Detects sequences of -10 and -35 in the major groove Sigma factor allows RNA polymerase to bind to promoter 原核生物转录的起始 第49页/共70页 A. 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 （ R位点被位点被因子发现并结合 ） B. 开

24、放型启动子复合物的形成开放型启动子复合物的形成 RNApol的一个适合位点到达的一个适合位点到达10序列区域，诱导富序列区域，诱导富 含含AT的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”， 形成形成1217bp的泡状物，的泡状物，同时酶分子向同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合序列转移并与之牢固结合 开放型启动子复合物使开放型启动子复合物使RNA聚合酶定向聚合酶定向 两种复合物均为二元复合物（全酶和两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA ）第50页/共70页 c. 在开放型的启动子复合物中，在开放型的启动子复合物中，RNApol的的I位点和位点和E位点的位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（

25、核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（ 亚基）亚基） 三元复合物形成三元复合物形成 +1位多为位多为CAT模式模式,位于离开保守位于离开保守T 69 个核苷酸处个核苷酸处 -6-9 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-19 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4） 因子解离 核心酶与核心酶与DNA的亲和力下降的亲和力下降 起始过程结束起始过程结束核心酶移动进入延伸过程核心酶移动进入延伸过程第51页/共70页转录的起始过程转录的起始过程核心酶核心酶1217bp第52页/共70页（亚基）亚基）第53页/共70页启动子各位点与转录效率的关系启动子各位点与转录效率的

26、关系（1）35 序列与序列与10 序列与转录效率的关系序列与转录效率的关系 标准启动子标准启动子 35 TTGACA 10 TATAAT第54页/共70页不同的启动子的区别：不同的启动子的区别： a. 与标准启动子序列同源性越高与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大启动强度越大 b. 与标准启动子同源性越低与标准启动子同源性越低 启动强度越小启动强度越小 c. 与标准启动子差异很大时与标准启动子差异很大时 由另一种由另一种因子启动因子启动 原因原因 -35序列通过被序列通过被 因子识别的容易程度因子识别的容易程度决定启动子强决定启动子强度度 -10序列影响开放型启动子复合物形成的速度序列影响

27、开放型启动子复合物形成的速度 决定启决定启动子强度动子强度 第55页/共70页 （2） 35序列与10序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要 间距非常重要，17bp的间距转录效率最高 间距上的突变种类： 间距趋向于17bp 上升突变 间距远离17bp 下降突变第56页/共70页 1、 RNA聚合酶的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性）（1）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于-25 -30处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37)定位转录起始点的功能 ,类似

28、原核生物的-10序列的序列的Pribnow框TATA框是绝大多数真核基因的正确表达所必需的 真核生物的启动子第57页/共70页（2） CAAT框（CAAT box） 位于-70-80区处 一致序列为GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要(转录效率) 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性（3） GC框（GC box） 在-80-110区，含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（4） 帽子位点 转录起始位点，碱基大多为A 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在第58页/共70页RNA聚合酶的启动子结构第59页/共70页 （5 5）增强子（enhancer）：能强化转录起始的序列为增强子或强化子。又称远上游序列（far upstream sequence）它是远距离调节启动子以增加转录速率的DNADNA序列，其增强作用与序列的方向无关，与它在基因的上下游位置无关。增强子有强烈的细胞类型选择，即不同细胞类型，增强作用不同。第60页/共70页Binding of Activator Factors Finally, high-level transcription is induced