免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化及大蒜多糖C的干预作用

1、    【摘要】  目的观察免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化并研究大蒜多糖C的干预作用。方法采用尾静脉注射卡介苗加脂多糖(BCG+LPS)建立免疫性肝损伤模型，应用流式细胞术测量小鼠外周血淋巴细胞亚群的百分比和CD4+/CD8+比值。结果模型组T淋巴细胞、CD8+ T细胞百分比值较正常对照组明显升高（P< 0.01），B淋巴细胞百分比值、CD4+/CD8+比值明显下降（P< 0.01），CD4+ T细胞百分比也有减少（P< 0.05），NK1.1+T细胞百分比无显著变化。大蒜多糖C（800 mg/kg ig，qd

2、5;12）治疗能使BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠外周血T，B，CD4+T和CD8+T淋巴细胞百分比显著下降，而CD4+/CD8+比值显著上升，恢复到正常水平，对NK1.1+T细胞百分含量则无明显影响。结论大蒜多糖C能全面抑制免疫性肝损伤小鼠的免疫功能，并促使机体建立新的免疫平衡，从而对免疫性肝损伤产生保护作用。 【关键词】  免疫 肝损伤 淋巴细胞亚群 大蒜多糖C 流式细胞术Abstract：ObjectiveTo observe the changes of lymphocyte subsets in the peripheral blood of mice with immuno

3、logical liver injury and intervention of Garlic Polysaccharide C.  MethodsThe animal immunological liver damage model was reproduced by injection via the tail vein of BCG (Bacilli Calmette Guein)and lipopolysaccharide(LPS) into miceThe peripheral-blood lymphocyte subsets' percentages and th

4、e CD4+/CD8+ ratio was measured by the flow cytometry.ResultsCompared with normal control group, the percentages of the T lymphocyte and the CD8+ T lymphocyte in the peripheral-blood in immunological liver damage mice siginificantly  increased（P< 0.01）,however, the percentages of the B lympho

5、cyte, CD4+T lymphocyte and  the ratio of CD4+/CD8+ decreased(P<0.05 or P< 0.01). Garlic polysaccharide C at dose of  800 mg/kg (ig，qd×12)  decreased the percentages of T,B,CD4+ T and CD8+ T lymphocyte in the peripheral-blood in mice treated with BCG+LPS,  however,the C

6、D4+/CD8+ ratio increased to the normal level. The percentages of the NK1.1+T lymphocyte showed no obvious difference between control, BCG+LPS liver injury model and Garlic Polysaccharide C groups.ConclusionGarlic Polysaccharide C can inhibit the immunologic activity, and establish a new immunologic

7、balance, thereby produce protective effects on immunological liver injury.Key words：Immunity;  Liver injury；  Lymphocyte subset；  Garlic polysaccharide C；  Flow cytometry    病毒性肝炎的损害与机体的免疫应答有密切的关系1。卡介苗联合脂多糖(BCG+LPS)诱导的免疫性肝损伤是研究病毒性肝炎发病机制及药物防治的有效实验模型2，3，此模型中小鼠外周血淋巴细胞

8、亚群的变化特征尚无定论。 大蒜药食同源，近来我们从大蒜球根中提取分离出新的安全低毒有效成分大蒜多糖C，并证实大蒜多糖C在体外有抗乙型肝炎病毒作用，对四氯化碳所致化学性及BCG+ LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠肝功能均具保护性作用35。为此，本研究则进一步观察BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化并研究大蒜多糖C的干预作用，以探讨大蒜多糖C护肝作用的相关免疫机制，寻求有效的抗病毒性肝炎药物。1  材料和方法1.1  主要药品及试剂大蒜多糖C：参照文献方法提取及纯化，纯度为92.335。卡介苗（BCG）活菌：兰州生物制品研究所产品，冻干粉剂，批号：20020501，

9、使用前用灭菌生理盐水配制成1的溶液。脂多糖（LPS）: SIGMA公司产品。小鼠单克隆抗体: FITC标记CD3试剂、PE标记CD19试剂、PE标记CD4试剂、PE标记CD8试剂以及相应同型对照，均为Caltag公司产品。流式鞘液及溶血剂（Immuno-Prep）均由Beckman Coulter公司提供。1.2  动物与仪器健康雄性昆明小鼠，体重2225g，由湖北医学科学院提供，适应1周后开始实验。主要仪器：美国Beckman Coulter公司 EPACS XL流式细胞仪。1.3  动物模型、分组、标本采集及制备采用卡介苗（BCG）加脂多糖（LPS）诱发的小鼠免疫性肝损

10、伤模型，即小鼠先尾静脉注射1% BCG活菌2 mg/只致敏，12 d后再尾静脉注射微量LPS（4g/只）诱导肝损伤。小鼠随机分为正常对照组、免疫性肝损伤模型组、大蒜多糖C治疗组(800 mg/kg ig，qd×12)，每组20只。实验第1天，模型组及大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射1% BCG溶液2 mg即0.2 ml，正常对照组尾静脉注射生理盐水(0.2 ml/只)。次日起，正常组和模型组ig生理盐水qd×12；大蒜多糖C组 ig 800 mg/kg  qd×12。末次给药后，模型组、大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射LPS 4 g，正常对照组给予等

11、容积无菌生理盐水。12 h后，小鼠摘眼球取血，收集于肝素抗凝管中备测。1.4  外周血淋巴细胞亚群比值测定应用流式细胞术检测。采用淋巴细胞亚群双色分析方案，按照仪器和检测试剂说明书进行。取待测肝素抗凝血样本100 l，分别加入相应抗小鼠抗体或同型IgG对照10 l，室温避光孵育20 min，加入溶血素溶解红细胞后，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，用1ml 0.001M的PBS重新悬浮细胞，200目过滤网过滤样本后上机检测。1.5  统计学分析实验数据以均数±标准差（ ±s）表示，两组间比较用t检验。2  结果 

12、60;  结果见表1。与正常对照组相比，模型组T淋巴细胞、CD8+T细胞百分比值明显升高（P< 0.01），B淋巴细胞百分比值、CD4+/CD8+比值明显下降（P< 0.01），CD4+T细胞百分比值也有减少（P< 0.05），NK1.1+T细胞百分比值无显著变化。大蒜多糖C治疗组T，B，CD4+T，CD8+T淋巴细胞百分比较模型组均明显下降（P< 0.01），甚至低于正常组水平（P< 0.05或P<0.01），而CD4+/CD8+比值明显上升（P< 0.01）并与正常组无显著差异（P 0.05）；NK1.1+ T细胞百分比值无显著差异。-

13、    The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of longan necleuses. It has a brilliant prospect in developing this natural resources. 【参考文献】  1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional

14、therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production technology question and answerM. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2001:56.3Tan Shuhui, Zhan Reting. Chinese medicine open country recognition handb

15、ook (2)M. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2004:208.4Nanjing college of pharmacy << Chinese medicine study >> compilation group Chinese medicine study (center book) M. Nanjing:Jiangsu People's Publishing Press,1976:628.5Xiao Gengsheng, Huang Ruqiang,Ceng Qingxiao,etc. Nutrition composition of Longan seedsJ.Food Science and Technology,2004,(1):93.6Xia Xingzhou, Zhang Hui, Wei Chuanwan. In the banyan tree leaf the flavonoid withdraws the condition researc