实验6——可溶性蛋白质的测定

1、1实验原理实验原理 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料料结合法的一种。该染料在游离状态下呈在游离状态下呈红红色色，最大光吸收在，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结当它与蛋白质结合后变为合后变为青色青色，蛋白质，蛋白质-色素色素络络合物在合物在595nm波长下有最大光吸收波长下有最大光吸收。其吸其吸光光值与蛋白质含值与蛋白质含量成正比量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。，故可用于蛋白质的定量测定。2. 适用范围与特点适用范围与特点 该法是该法是1976年年Bradford建立，试剂配制简单建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏

2、，灵敏度比，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法（劳里法）还高法（劳里法）还高4倍，可测定微克级蛋白倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为质含量，测定蛋白质浓度范围为01000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 该法的不足是当蛋白质含量过高时，线性关该法的不足是当蛋白质含量过高时，线性关系较差，重复性也较差，同时染料很容易结合到系较差，重复性也较差，同时染料很容易结合到比色皿上，给实验结果造成一定误差。比色皿上，给实验结果造成一定误差。3. 实验材料、仪器与试剂实验材料、仪器与试剂材料：材料：豆芽豆芽仪器：仪器：可见分光光度

3、计，分析天平，容量瓶可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏斗，铁架台，玻璃棒。斗，铁架台，玻璃棒。试剂：试剂：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸，无水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。牛血清蛋白。试剂配制：试剂配制：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250试剂：试剂：称取称取0.1000g考马斯考马斯亮蓝亮蓝G-250，溶于，溶于50mL95%乙醇中，加入乙醇中，加入85%磷酸磷酸100mL，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000mL。标准蛋白质溶液（标准蛋白质溶液（100g/mL）：）：称取称取0.0100g牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSA），

4、溶于），溶于100mL蒸蒸馏水中。馏水中。4. 实验步骤实验步骤（1）样品处理：）样品处理： 准确称取准确称取5g豆芽于研钵中，充分研磨豆芽于研钵中，充分研磨后转移至后转移至100mL容量瓶中，静置容量瓶中，静置20min后过后过滤，弃去初滤液后备用。滤，弃去初滤液后备用。（2）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制 123456BSA（mL）00.20.40.60.81水（水（mL）10.80.60.40.20蛋白质含量蛋白质含量（g）020406080100 取取6支支10mL具塞试管，按上表加入试剂具塞试管，按上表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入，混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮考马斯亮

5、蓝蓝G-250溶液，稀释至刻线溶液，稀释至刻线10mL（则蛋白质则蛋白质浓度分别为浓度分别为0、2、4、6、8、10g/mL ），），摇匀，放置摇匀，放置5min后于后于595nm波长下比色。以波长下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。制标准曲线。（3）样品的测定）样品的测定 另取另取3支支10mL具塞试管，分别吸取样具塞试管，分别吸取样品溶液品溶液0.6mL，各加入，各加入5mL考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250溶液，稀释至刻线溶液，稀释至刻线10mL，充分混合，充分混合，放置放置5min后于后于595nm波长下比色，测定吸波长下比色，

6、测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。5. 结果计算结果计算 蛋白质含量（蛋白质含量（%）=CV2V0 mV1 100式中：式中： C从标准曲线上查得的蛋白质浓度，从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL V0样品溶液的总体积，样品溶液的总体积，mL V1测定时加样量，测定时加样量，mL V2测定时定容体积，测定时定容体积，mL m 样品的质量，样品的质量，g6. 注意事项注意事项 （1）考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德）考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑

7、细胞普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。自然衰老脱落即可无碍。 （2）考马斯亮蓝有考马斯亮蓝有G-250和和R-250两种。两种。 蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下，其结合物在室温下1h内保持稳定。内保持稳定。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比与蛋白质反应虽然比较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对电泳条带染色。电泳条带染色。 （3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染）不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少量量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。的乙醇荡洗，以洗去染色。 （4）H+浓度是影响线性关系的主要因素，浓度是影响线性关系的主要因素，控制好显色液的控制好显色液的H+浓度