膨胀床吸附技术

1、膨胀床吸附技术膨胀床吸附技术膨胀床吸附膨胀床吸附1.膨胀床与传统固定床的区别膨胀床与传统固定床的区别2.膨胀床与流化床的区别膨胀床与流化床的区别膨胀床与传统固定床的区别在于：膨胀床与传统固定床的区别在于：膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的膨胀床的床层上部安装有可调节床层高度的调节器，当液体调节器，当液体(料液或清洗液等料液或清洗液等)从床底以高从床底以高于吸附剂最小流化速度的流速输人时，吸附于吸附剂最小流化速度的流速输人时，吸附剂床层产生膨胀，高度调节器上升，膨胀床剂床层产生膨胀，高度调节器上升，膨胀床状态下床层高度一般为固定床状态的状态下床层高度一般为固定床状态的23倍，倍，床层空隙率高

2、，允许茵体细胞或细胞碎片自床层空隙率高，允许茵体细胞或细胞碎片自由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接处理由通过。因此，膨胀床吸附操作可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物，从而可节省离心或过滤竿预处理过程，产物，从而可节省离心或过滤竿预处理过程，提高目标产物收率，降低分离纯化过程成本。提高目标产物收率，降低分离纯化过程成本。这是膨胀床吸附操作的最大诱人之处。这是膨胀床吸附操作的最大诱人之处。膨胀床与流化床的区别：膨胀床与流化床的区别：膨胀床并非传统的流化床，两者的区膨胀床并非传统的流化床，两者的区别在于：后者的吸附型粒子和液体在别在于：后者的吸

3、附型粒子和液体在床层内混合程度高，吸附效率低，而床层内混合程度高，吸附效率低，而前者的吸附剂粒子基本悬浮于固定的前者的吸附剂粒子基本悬浮于固定的位置，液体的流动与固定床相似，接位置，液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率高。因此，膨胀近平推流，吸附效率高。因此，膨胀床的形成需要特殊的吸附剂和设备结床的形成需要特殊的吸附剂和设备结构。构。操作流程操作流程缓冲液膨胀：缓冲液膨胀：首先确定适宜的膨胀度，使介质颗粒在流动的流体中首先确定适宜的膨胀度，使介质颗粒在流动的流体中分级。一般认为，流速为分级。一般认为，流速为100-300cm/h，使床层膨胀到固定床高度，使床层膨胀到固定床高度的两倍时，

4、吸附性能最好；的两倍时，吸附性能最好；进料吸附：进料吸附：利用多通道恒流泵，将缓冲液切换成原料液，根据流量利用多通道恒流泵，将缓冲液切换成原料液，根据流量计中转子的位置和床层高度的关系调节流速，保持恒定的膨胀度进计中转子的位置和床层高度的关系调节流速，保持恒定的膨胀度进行吸附，通过对流出液中目标产物的检测和分析，确定吸附终点；行吸附，通过对流出液中目标产物的检测和分析，确定吸附终点；洗涤：洗涤：在膨胀床中，用具有一定黏度的缓冲液冲洗吸附介质，既冲在膨胀床中，用具有一定黏度的缓冲液冲洗吸附介质，既冲走滞留在柱内的细胞或细胞碎片，又可洗去弱吸附的杂质，直至流走滞留在柱内的细胞或细胞碎片，又可洗去弱

5、吸附的杂质，直至流出液中看不到固体杂质后，改用固定床操作；出液中看不到固体杂质后，改用固定床操作；洗脱：洗脱：采用固定床操作，将配制好的洗脱剂用恒流泵从柱上部导入，采用固定床操作，将配制好的洗脱剂用恒流泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并分析检测目标产物的活性峰位置和最大活下部流出，分段收集，并分析检测目标产物的活性峰位置和最大活性峰浓度。性峰浓度。再生和清洗：再生和清洗：直接从浑浊液中吸附分离、纯化目标产物如蛋白质时，直接从浑浊液中吸附分离、纯化目标产物如蛋白质时，存在有非特异性吸附，虽经洗涤、洗脱等步骤，有些杂质可能还难存在有非特异性吸附，虽经洗涤、洗脱等步骤，有些杂质可能还难以除净。为

6、提高介质的吸附容量，必须进行清洗使介质再生，一般以除净。为提高介质的吸附容量，必须进行清洗使介质再生，一般在使床层膨胀到堆集高度在使床层膨胀到堆集高度5倍左右时的清洗液的流速下，经过倍左右时的清洗液的流速下，经过3小时小时的清洗，可以达到再生的目的。的清洗，可以达到再生的目的。蛋白质在膨胀床吸附层析剂的蛋白质在膨胀床吸附层析剂的静态和动态吸附性能静态和动态吸附性能胡洪波 姚善泾 朱自强(浙江大学化工学院生物化工研究所, 杭州310027)以牛血清白蛋白(BSA) 为目标蛋白, 考察膨胀床用离子交换树脂Streamline DEAE 的静态和动态吸附性能, 并和离子交换树脂DEAE Sephar

7、ose FF 进行比较, 实验发现两者的静态吸附性能相似,而动态吸附性能差别较大。根据动态吸附数据计算出液膜扩散系数和孔内扩散系数。 膨胀床吸附层析技术自膨胀床吸附层析技术自90 年代被开发以来年代被开发以来,由于在减少操作步骤由于在减少操作步骤, 提高产品收率提高产品收率, 降低纯化费用和资本投入方面的优势降低纯化费用和资本投入方面的优势, 因而在生化分因而在生化分离中的应用越来越广泛离中的应用越来越广泛17 。St reamline DEAE 是是Amersham PharmaciaBiotech 公司专门为膨胀床设计的弱阴离子交换层析介公司专门为膨胀床设计的弱阴离子交换层析介质质, 与常

8、用的离子交换层析剂不同的是与常用的离子交换层析剂不同的是, 它有一惰性石英砂内核它有一惰性石英砂内核, 6 %的交联琼脂糖被包在石英砂核外的交联琼脂糖被包在石英砂核外, 并且其密度和粒径有一分布。并且其密度和粒径有一分布。在利用该层析剂进行分离时在利用该层析剂进行分离时, 研究静态和动态平衡吸附行为可以为研究静态和动态平衡吸附行为可以为考察层析剂对产物的吸附量和研究层析过程的传质速率考察层析剂对产物的吸附量和研究层析过程的传质速率, 提供一些提供一些必要的参数必要的参数。由于目前尚无计算具有粒径分布且含惰性内核吸附剂。由于目前尚无计算具有粒径分布且含惰性内核吸附剂的吸附动力学模型和方法的吸附动

9、力学模型和方法, 给描述动态吸附过程带来了困难。本文给描述动态吸附过程带来了困难。本文拟以拟以BSA 为目标蛋白为目标蛋白, 研究其在研究其在St ream2line DEAE 上的静态和动上的静态和动态吸附性能态吸附性能, 并与另一种层析剂并与另一种层析剂DEAE Sepharose FF 的吸附性能的吸附性能进行比较进行比较,试图建立起蛋白质在含惰性内核层析剂吸附性能的数学模试图建立起蛋白质在含惰性内核层析剂吸附性能的数学模型型, 计算吸附过程的平衡热力学参数和扩散系数。计算吸附过程的平衡热力学参数和扩散系数。实验材料及方法实验材料及方法1. 1 1. 1 实验材料实验材料BSA : BS

10、A : 华美生物工程公司华美生物工程公司; DEAE Sepharose; DEAE SepharoseFF , St reamline DEAE : FF , St reamline DEAE : 瑞典瑞典A. Pharmacia BiotechA. Pharmacia Biotech公司公司; ; 低温恒温槽低温恒温槽: : 宁波市机电工业研究设计院宁波市机电工业研究设计院; ;UV - 1 UV - 1 紫外检测仪紫外检测仪: : 瑞典瑞典A. Pharmacia Biotech A. Pharmacia Biotech 公司。公司。1. 2 1. 2 实验方法实验方法1. 2. 1 1

11、. 2. 1 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定BSA BSA 用紫外分光光度法分析用紫外分光光度法分析, , 波长为波长为280nm280nm。1. 2. 2 1. 2. 2 静态吸附性能静态吸附性能用缓冲液配制用缓冲液配制8. 0 mg/ mL 8. 0 mg/ mL 的标准的标准BSA BSA 溶液溶液, ,把其稀释成不同浓度的溶液把其稀释成不同浓度的溶液, , 取各浓度溶液取各浓度溶液15mL , 15mL , 置于置于25mL 25mL 具塞锥形瓶内具塞锥形瓶内, , 加入加入1mL 1mL 与缓与缓冲液冲液1111混匀的吸附剂混匀的吸附剂, , 置于恒温水浴置于恒温水浴161617h

12、 ,17h ,让其达到平衡。将溶液离心让其达到平衡。将溶液离心, , 取上清液取上清液, , 测定测定BSA BSA 的浓度的浓度, , 再根据物料衡算求得吸附剂吸附的再根据物料衡算求得吸附剂吸附的BSA BSA 量。量。1. 2. 3 1. 2. 3 动态吸附性能研究动态吸附性能研究动态吸附实验装置如图动态吸附实验装置如图1 1 所示。将吸附池置于所示。将吸附池置于恒温水浴中恒温水浴中, , 由一恒流泵连接吸附池和紫外检测由一恒流泵连接吸附池和紫外检测仪。恒流泵以恒定的流速通过紫外检测仪的检测池仪。恒流泵以恒定的流速通过紫外检测仪的检测池, , 再返回吸附池再返回吸附池, , 如如此循环此循

13、环, , 直到记录仪显示平衡已到达为止。直到记录仪显示平衡已到达为止。 结语结语 考察了膨胀床离子交换层析介质考察了膨胀床离子交换层析介质St reamlineDEAE 的静态和动态吸附性能的静态和动态吸附性能, 并和常用的离子交并和常用的离子交换层析介质换层析介质DEAE Sepharose FF 进行比较进行比较, 发现两发现两者静态吸附性能比较相似者静态吸附性能比较相似, 而动态吸附性能差别较大。而动态吸附性能差别较大。 提出具有粒径分布和含有惰性内核吸附剂的吸提出具有粒径分布和含有惰性内核吸附剂的吸附动力学模型附动力学模型, 采用正交配置法采用正交配置法, 解得了微分方程解得了微分方程

14、组解组解, 计算得到了两种吸附剂的液膜扩散系数和孔计算得到了两种吸附剂的液膜扩散系数和孔内扩散系数内扩散系数, 其中两者的液膜扩散系数相等其中两者的液膜扩散系数相等, 而而St reamline DEAE 的孔内扩散系数要大于的孔内扩散系数要大于DEAESepharose FF。 参考文献参考文献1 胡洪波, 姚善泾, 朱自强. 生化分离的新技术扩张床吸附层析. 化学工程, 1999 , 27 : 37.2 Chase H A. Purification of proteins by adsorption chro2matography in expanded beds. Trends in

15、Biotech , 1994 ,12 : 296.3 Thoemmes J , Bader A , Halfar M , et al. Isolation ofmonoclonal antibodies from cell containing hybridoma brothusing a protein A coated adsorbent in expanded bed. JChromatogr A , 1996 , 752 : 111.4 Batt B C , Yabannavar V M , Singh V. Expanded bed ad2sorption process for p

16、rotein recovery from whole mammaliancell culture broth. Bioseparation , 1995 , 5 : 41.5 Chang Y K, Chase H A , Ion exchange purification ofG6PDH from unclarified yeast cell homogenate using ex2panded bed adsorption. Biotech Bioeng , 1996 , 49 : 204.6 Chang Y K, Chase H A , Development of an expanded

17、 bedtechnique for an affinity purification of G6PDH from unclar2ified yeast cell homogenates. Biotech Bioeng , 1995 , 48 :355.膨脹床吸附技術應用在酵素的直接膨脹床吸附技術應用在酵素的直接回收程序：以回收程序：以 -配醣酵素為例配醣酵素為例蘇家弘 張煜光 明志技術學院生化工程系摘要摘要本研究係發展一種新的酵素純化技術本研究係發展一種新的酵素純化技術-即膨即膨脹床吸附技術，從未澄清麵包酵母菌研磨脹床吸附技術，從未澄清麵包酵母菌研磨液中，有效的直接回收液中，有效的直接回收-配

18、醣酵素配醣酵素。 生物技術突飛猛進，日新月異，已被公認為二十一世紀最具發展潛力之科技。而其應用範圍函蓋醫學、食品、特用化學品、環保、能源等工業，以及農林魚牧與海洋等產業，為人類帶來相當多的福祉。而生化工程正是在研究此一問題。生化工程之努力方向以生產高級產品為主，這是有別於其他傳統的工業，而目前有許多產品具有相當的商業化潛力，但生化產品在下游分離純化步驟的費用，約佔總消耗成本的70-80%1，對於產品的產能有其相當大的影響。流體化床層析技術，是最近所開發出來的一種酵素純化方法，它具有相當多的優點，接下来將針對此法的特性、原理做探討，以及實際運用在酵素純化程序之設計。2.1 材料材料STREAML

19、INE DEAE與STREAMLINE Phenyl樹脂購自Pharmacia BioProcess Ltd.。其他所有化學試劑，購自Sigma Chemical Co. 2.2 設備設備固定床層析管柱(HR 10/10, i.d. 1.0 cm)與膨脹床層析管柱(STREAMLINE 25, i.d. 2.5 cm)，購自Pharmacia BioProcess Ltd.。層析系統Gradific system with pump p-50，購自Pharmacia BioProcess Ltd.。紫外線分光光度計Model UV-1201，Shimadzu Scientific Instru

20、ments, Inc.。蠕動幫浦Model 302S/R，購自Watson-Marlow Co。破碎細胞溶液配製破碎細胞溶液配製將購買的塊狀酵母與20mM磷酸鹽溶液(pH 8.0)配成50%重量百分濃度，再加入等重500m的玻璃珠，利用高速攪拌機在4,800rpm轉速將細胞打破2，每攪拌一分鐘，冷卻二分鐘，連續15次，完畢後，取出破碎酵母菌液，用緩衝溶液稀釋備用。酵素回收程序酵素回收程序將適量樹脂導入STREAMLINE 25管柱，使其固定床體積為60ml(樹脂高約12公分)。配合簡易的蠕動幫浦層析系統，在適當流率注入緩衝溶液，使床膨脹至2倍高(約24公分)，然後注入適量非澄清的破碎酵母菌溶液(346ml)，再以10%甘油洗滌溶液去除管柱中的細胞雜質，為保持床等高與穩定性，因此操作過程中需要調整流速。待完全移除固體微粒，將床回覆至固定床高(約12公分)，選擇適當鹽類溶液來沖提管柱，流出的菌液以自動收集器收集之，離心後測定每根試管每毫升溶液中酵素的活性含量與蛋白質總量。等溫吸附之探討等溫吸附之探討依Langmuir