生化工艺理论课复习资料

1、生化工艺理论课复习提纲第一章 绪论 1.生物技术产品的特点 （1）生物活性结构复杂 （2）分布广泛胞内胞外 （3）原始浓度偏低 （4）组分复杂 （5）产物稳定性差 批间差异大 （6）质量要求高（生物医药） （7）经济性 2.生物分离纯化技术的特点 （1）环境复杂、分离纯化困难 （2）含量低、工艺复杂 （3）稳定性差、操作要求严格 （4）目标产物最终的质量要求很高 （5）终极产品纯度的均一性与化学分离上纯度的概念并不完全相同 （6）操作条件（环境）严格、无菌或密封 3.生物分离纯化技术选择依据 目标产物与杂志之间的生物学和物理化学性质上的差异 4.以发酵液为例，生物分离纯化的一般工艺流程第二章

2、发酵液的预处理 1.发酵液预处理目的（1）改变料液性质,促进固液分离，提高分离效率（2）除去部分杂质(杂蛋白和不溶性的多糖等），以利后续操作（3）尽可能使产物转移到后处理的相(液）中，利于提取和精制的顺利进行。 2.常见发酵液预处理方法 过滤特性的改善 a、加热（降低黏度、去除杂蛋白） b、pH、稀释 c、凝聚与絮凝（增大粒度） d、加助滤剂（改善过滤） 杂质的去除 a、去杂蛋白（等电点、变性剂、吸附） b、去多糖（酶解） c、去离子（沉淀） 3.凝聚、絮凝与盐析联系： 絮凝、凝聚和盐析都是使蛋白质等胶体从溶 液中析出的方法，但其原理和方法有所不同。区别： 絮凝是指通过聚电解质的架桥作用，将溶

3、液中的蛋白质连接起来，增大蛋白质的尺度而不是蛋白沉淀。凝聚和盐析虽然都是采用无机盐使蛋白质沉淀，但凝聚所用的是含有高价离子的无机盐，主要是由于蛋白质与带相反电荷的高价离子发生电荷中和作用而使得蛋白质聚集沉淀，所以凝聚所需的盐浓度很低。而盐析使用的是中性盐，主要依靠盐离子的亲水性，夺走与蛋白质亲和的水而沉淀，因而盐析通常需要较高的盐浓度。 4.助滤剂-定义、原理 （1）定义： 助滤剂是一种质地坚硬、颗粒均匀，不可压缩的，具有吸附胶体能力的惰性物质。 （2）原理： 助滤剂具有吸附胶体能力，可以改变滤饼的结构（使其成网状），降低滤饼的可 压缩性（可压缩变成部分可压缩），从而降低过滤的阻力，加快过滤速

4、度。 5.改善过滤的方法 a. 降低黏度：加水稀释和加热 b. 调整pH c、加入反应剂 d、加入助滤剂 e、增大悬浮颗粒体积 f、操作条件的改变 6. 错流过滤（定义）：悬浮液在过滤介质表面做切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体带走的方 1.细胞破碎的定义、方法有哪些？ 定义：用物理、化学、酶或机械的方法破坏细胞壁或细胞膜。 方法： （1）机械破碎： 高压匀浆法、珠磨法、超声波破碎法、X-press法 （2）非机械破碎：酶溶法、化学试剂法、渗透压冲击法、反复冻融法、干燥法 2.高速球磨与高压匀浆的影响因素 高速球磨：搅拌速度 适中 a. 破碎速率与外缘速度成正比（一定范围） b.

5、外缘速度增加，热量与消耗的功率增加，产物失活率增加 细胞浓度最佳 珠粒的大小、用量 a.珠粒越小，细胞破碎速度越快（太小，易于漂浮）0.2mm。 b.用量越多，细胞破碎速度越快（8090填充密度） T5-40 流量小 (6)微生物 高压匀浆：a. T b.操作压力 3.细胞破碎方法的选择依据 (1) 目标生化物质的位置： (2) 目标生化物质对破碎条件的敏感性： (3) 破碎程度、目的 (4) 规模、经济 4.各破碎方法的原理及应用 5.包涵体（定义）细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒第三章 固相析出分离技术 1.可逆沉淀与不可逆沉淀 可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀；

6、 不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀 2.盐析-定义、原理及影响因素 盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质 在水溶液中的溶解度随盐浓度的升高会急剧下降，并产生沉淀， 这种现象称为盐析。盐析原理a.盐亲水性大于pr亲水性破坏水化模 b.盐离子中和pr分子表面电荷，静电斥力减弱。 影响因素： 盐饱和度的影响、样品浓度的影响、ph的影响、温度的影响 影响因素： (1)溶质种类的影响： (2)溶质浓度的影响： 蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高 (3)pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH

7、值使其在pI附近；且pr稳定性好 (4)盐析温度-常温 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降 3.有机溶剂沉淀-原理、常见沉淀剂（或条件）及影响因素 . 有机溶剂沉淀原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降低了亲水性，导致脱水凝聚破坏水化膜。 （3）加有机溶剂后，pr等分子的空间结构可能发生变化，使内部疏水基团部分外露，并与有机溶剂的疏水基团结合成疏水层，从而使蛋白沉淀。 常用的有机溶剂沉淀剂（或条件）：乙醇（常用于蛋白质、核酸、多糖等 生物大分子

8、的沉淀）、丙酮、甲醇 影响因素：（1）温度预冷：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收 率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热） （2）搅拌速度散热 （3）溶液pH值：目标蛋白与杂质带有相同的电荷，pI附近； 稳定性好 （4）离子强度: 离子强度低有利于沉淀，0.010.05mol/L （5）样品浓度: 0.52% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 4.沉淀与结晶的区别 联系：沉淀法与结晶法都是将溶质以固体形式从溶液中析出的方法 区别：沉淀是利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解 度；结晶是 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而

9、 结合成晶体。两者的区别在于构成单位的排列方式不同，晶体的 原子、离子或分子排列是规则的，而沉淀是不规则的。 5.影响结晶的因素 (1)杂质： a.促进生长、抑制生长、影响晶体外形 b.其透经不同：晶体内、吸附在晶体表面、晶体与溶液界面上的液层 (2)搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成； (3)温度：T升高有利于扩散，增加结晶速度； (4)过饱和度：过饱和度增高一般使晶体生长速度增大，但粘度增大，结 晶速度受阻 第四章 萃取技术 1.基本概念：萃取、反萃取、分配定律及分离系数 萃取:利用溶质在互不相溶的两相中溶解度(或分配系数）的不同而使溶质得到化 或浓缩的技术。 反萃取:将目标产物从有机相转

10、入水相的萃取操作。 分配定律：在恒温恒压条件下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，在两相 中的平衡浓度之比为常数。 分离系数：萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素来表征 Ka/Kb 2.各种萃取方式的流程图(P135)与特点 特点： 单级萃取:操作简单、快速，但对分配系数不大的产物分离时回收率低 多级错流萃取:回收率较高、但溶剂用量大、产物浓度低、能耗较大 。 多级逆流萃取：萃取效率高，萃取相中目标产物浓度高；溶剂用量少。 3.有机溶剂萃取： （1）影响因素（pH）a) 萃取剂的性质b) 原溶剂（B）的 pH值对弱电解质分配系数均具有显著影响。弱酸性电解质的分配系数随pH降低(即氢

11、离子浓度增大)而增大，而弱碱性电解质则正相反。c) 温度适宜d) 盐析（2）萃取剂具备的条件a) 萃取容量大（如青霉素）b) 有较高的选择性c) 不与目标产物发生反应，并且与水相不互溶；（d）与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；（e）有链烃或芳烃，水溶性低（f）价廉易得；容易回收和再利用；（7）毒性低，腐蚀性小，使用安全。（3）乳化（定义、类型、形成条件、不利影响及消除方法）定义：一种液体以细小液滴（分散相）的形式分散在另一互不相容的液体（连续相）中。类型油包水（W/O ）型和水包油（O/W ）型两大类乳状液形成的条件a.互不相溶的两相溶剂b.表面活性剂使有机

12、溶剂（油）和水的表面张力降低 不利影响:相分离困难；夹带目的物，导致收率低a) 去乳化方法：加热、稀释、吸附b) 离心或过滤（乳化现象不严重 ）c) 加强电解质，破坏乳状液双电层d) 转型：加相反的界面活性剂，促使乳状液转型。（如：对于o /w乳状液，加亲油性表面活性剂如SDS ，可使o /w向w/o转化，但由于溶液条件不允许w/o的形成，从而达到破乳目的，相反对于w/o型乳浊液，加入亲水性表面活性剂可达到破乳的目的）。e) 加入表面活性更强的物质，把界面活性剂替代出来的顶替法f) 凝聚或絮凝等预处理4.双水相萃取（1）双水相萃取特点 (a) 条件温和，保留产物活性(b) 通用性强（大分子及小

13、分子萃取）(c) 步骤简单,可连续操作（除去细胞的同时纯化蛋白质）、易于放大(d) 细胞碎片不需要去除(e) 成本高（2）双水相形成的条件、相图条件：至少有一种亲水性很强的高聚物，另一种可以是亲水性很高的无机盐或高聚物相图:（3）双水相体系的类型及原因类型：1、 两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）2、非离子型高聚物和离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）3、两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠）4、高聚物和无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）原因：1、聚合物/聚合物体系高聚物不相容性2、对于聚合物/无机盐双水相系统主要是由于盐析作用分相的（4）聚合物

14、的不相容性（5）影响双水相萃取的因素1. 双水相中聚合物组成的影响2. 双水相中聚合物浓度影响3.盐与缓冲液 4.pH5. 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度)5.反胶团萃取 （1）反胶团萃取的特点a) 成本低b) 选择性好、萃取率和反萃取率高c) 操作方便、放大容易d) 萃取剂 (反胶团相 )可循环利用e) 蛋白质不易变性等优点f) 影响因素多 （2）胶团与反胶团的定义、结构特征胶团：表面活性剂分子的两亲性质使之在水溶液中能自发形成结构有序的多分子聚集体反胶团：是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后,其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核(polar

15、core)的多分子聚集体结构特征：胶团：极性头向外，非极性头向内，形成非极性核，溶解非极性化合物 反胶团：极性头向内，非极性头向外，形成极性核（3）表面活性剂的结构、种类 结构：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极 种类：可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。（4）反胶团萃取的影响因素（pH、离子强度）a) 水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态；b) 离子强度对萃取率的影响以下几个方面： 影响蛋白质与表面活性剂极性基团的静电作用； 影响反胶团的大小； 离子进入“微水池”影响其他溶质的进入。c) 表面活性剂类型及浓度的影响d) 离子种类对萃取的影响e) 影响

16、反胶束结构的其他因素 1）有机溶剂的影响 2）温度的影响 3） 助表面活性剂6.超临界流体萃取 （1）基本概念（夹带剂、Tc、Tp） 超临界流体（SCF）：温度和压力均超过临界点时，物质介于气体和液体之间的一 种特殊的非凝缩性的高密度流体。 临界温度（Tc）：当温度超过Tc后，不管施加多大的压力，都不能使气体变为液 体是气体能够液化的最高温度。 临界压力（pc）：是指在临界温度下，气液平衡时的压力。 夹带剂：在纯流体中加入少量与被萃取物亲和力强的组分，以提高其对被萃取组分 的选择性和溶解度夹带剂，也称为改性剂或共溶剂。 （2）超临界流体萃取原理 原理：利用超临界流体在临界区附近，温度和压力微小

17、的变化，而引起流体密度大 的变化，而非挥发性溶质在超临界流体中溶解度大致和流体的密度成正比。 （3）超临界流体的特性 a.无明显的气液界面，既不是气体，也不是液体；是一种气液不分的状态。 b.性质介于气体和液体之间 c.密度随T、P变化明显，溶质的溶解度随流体的密度增大而增大。（ （4）超临界流体具备的条件 萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性； 临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作温度附近： 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度； 临界压力低，可节约压缩动力费； 选择性要好，容易得到高纯度制品； 溶解度要高，可以减少溶剂的循环量； 萃取溶剂要容易获取，价格要便宜。 当在医

18、药、食品等工业上使用时，萃取溶剂必须对人体没有任何毒性，这一点也 是很重要的。 （5）超临界流体萃取工艺流程（3种） 1)等T法依靠压力变化的萃取分离法 a.萃取壶T分离壶T b.萃取壶P分离壶P 2)等压法依靠温度变化的萃取分离法 a.萃取壶T分离壶T b.萃取壶P分离壶P 3)吸附法用吸附剂进行的萃取分离法 在分离器中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取器循环使用。 PS：a.方法（1）（2）主要用于萃取相溶质为需要的精制品 b.方法（3）萃取相溶质溶质为需要除去的有害成分或杂质第五章 膜分离过程 1.膜的分类 按膜的孔径：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜 按膜的结构：对称性

19、膜、非对称性膜、复合膜等 按膜的材料：合成聚合物膜、无机材料膜等 2.各种膜分离的原理、特点及应用 .微滤(MF)原理：利用微孔滤膜的筛分作用，在静压力差推动下，将滤液中尺寸 大小 0.01-10um的微生物和微粒子截留下来，实现溶液分离、 浓缩的技术。 特点 ( I ) 微滤过程不受渗透压影响 （II）渗透量远大于纳滤、超滤、反渗透 （III）操作压0.05-0.5MPa 应用：（I）微生物的检测（饮用水中大肠杆菌、医药制品细菌） （II）微粒子的检测（注射剂中不容性异物） 超滤(UF)原理：根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的 差别进行分离的方法。（相对分子质量较小的溶

20、质和水分透过膜， 而相对分子质量较大的溶质被截留。）特点：膜材料本身无毒性，对所滤溶液及产品无害 除醋酸纤维素膜外，许多高分子合成膜均有较好的耐酸碱、耐溶剂性能 设备简单经济，安装操作方便 一次处理可完成浓缩及精制工作 超滤装置整体为密闭系统，可减少污染机会，清洗消毒方便，可重复使用 操作过程无相变 操作过程不需要改变溶液的ph及离子强度 低压操作，不引起截留物的切变损害，不形成气溶胶，不引起产品变性或失活应用： UF膜的孔径较MF膜小，主要用于处理不含固形成分的料液；纯化浓缩大分子物质（蛋白质、酶、病毒等） 反渗透（RO)：若在溶液的一侧施加一外压，当此压力大于渗透压时，迫使浓溶 液中的溶剂

21、反相（如B侧溶液中 (水)透过到A侧）透过膜向稀溶 液一侧扩散。 特点 压力（1.010MPa）大于超滤、微滤、纳滤，膜孔致密。 溶剂从盐类、糖类等浓溶液中透过膜。 应用：海水脱盐、超纯水制备、发酵液中溶剂的分离（乙醇、丙酮等）、浓缩AA、 维生素等 纳滤技术 纳滤是介于反渗透与超滤之间的一种以压力为驱动力的新型膜分离过程。 特点在过滤分离过程中，它能截留小分子的有机物并可同时透析出盐，即集浓缩 与透析为一体； 操作压力低，因为无机盐能通过纳米滤膜而透析，使得纳米过滤的渗透压远 比反渗透为低，这样，在保证一定的膜通量的前提下，纳米过滤过程所需的 外加压力就比反渗透低得多，具有节约动力的优点。

22、应用：a.纳米过滤在抗生素的回收与精制上的应用 b.纳米过滤在各类肽的纯化与浓缩中的应用 电渗析原理：a) 在离子交换膜表面和孔内共价键合有可解离的基团，如磺酸基(SO3H）等酸性阳离子基和季铵基(NR3 ·OH)等碱性阴离子基。b) 解离后固定在膜上的基团带正电荷的膜称作阴离子交换膜，解离后固定在膜上的基团带负电荷的膜称作阳离子交换膜。 c) 在电场的作用下，前者选择性透过阴离子，后者选择性透过阳离子。适用： 小分子电解质(例如氨基酸、有机酸)的分离和溶液的脱盐、海水脱盐。膜 分 离 法传质推动力分 离 原 理应 用 举 例微 滤 （MF）压差0.050.5筛 分除菌，回收菌，分离

23、病毒超 滤压差0.11.0筛 分蛋白质、多肽和多糖的回收和浓缩反 渗 透压差1.010筛 分盐、氨基酸、糖的浓缩、淡水制造渗 析浓 差筛 分脱盐，除变性剂电 渗 析电 位 差电荷、筛分脱盐，氨基酸和有机酸分离渗透气 化分压差、温差溶质与膜的亲和作用有机溶剂与水的分离，共沸物的分离 3.浓差极化定义与消除方法 定义：在膜分离过程中，膜表面上溶质浓度高于主体溶质浓度而使得溶质向溶液主 体扩散的现象称为浓差极化。 方法：高速、低压、升温、清洗等 4.截留率（MWCO）：是指对一定分子量的物质来说,膜所能截留的程度 5.膜污染定义、原因及减小的方法 定义：指由于悬浮物或可溶物质沉积在膜的表面、孔隙内壁

24、,从而造成膜通量降低的过程团原因：凝胶极化引起的凝胶层，阻力为Rg 。 溶质在膜表面的吸附层，阻力为Ras 。 膜孔堵塞，阻力为R 膜孔内的溶质吸附，阻力为Rsp 方法： a.预处理供给液、膜 b.加大流速 c.开发抗污染膜 d.膜的清洗 6.膜组件定义、类型及各自优缺点.膜组件：由膜、固定膜的支撑体以及收纳这些部件的容器构成的一个单元类型：管式、平板式、螺旋卷式、中空纤维（毛细管）组件优 点缺 点板框式保留体积小，操作费用低的压力降，液流稳定，比较成熟投资费用大，大的固含量会堵塞进料液通道，拆卸比清洁管道更费时间螺旋卷式设备投资低，操作费用也低，单位体积中所含过滤面积大，换新膜容易料液需经预

25、处理，压力降大，易污染，难清洗，液流不易控制管 式易清洗，单根管子容易调换，对液流易控制，无机组件可在高温下用有机溶剂进行操作并可用化学试剂来消毒高的设备投资和操作费用，保留体积大，单位体积中所含有过滤面积较小，压力降大中空纤维式保留体积小，单位体积中所含过滤面积大，可以逆流操作，压力较低，设备投资低料液需要预处理，单根纤维管损坏时，需调换整个组件，不够成熟第六章 色谱技术 1.分类 （1）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类： 离子交换色谱分离法 吸附色谱法 分配色谱法 亲和色谱 凝胶色谱 （2）根据固定相的形状不同的分类： 柱色谱法、薄层色谱法 （3）根据流动相的物态不同的分类 ：

26、 液相色谱（LC）：LLC、LSC 气相色谱（GC）：GLC、GSC （4） 根据流动相与固定相的极性分类 ： 正相色谱：固定相极性大于流动相 反相色谱：固定相极性小于流动相 2.基本概念（保留时间、保留体积） 保留时间（tR）：从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。 保留体积（VR）：从开始进样到柱出口处 被测组分出现浓度最大值时所通过的流动相的体积 3.分配系数与Rf 分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值 分配系数（K）与迁移率（Rf）关系： K大，Rf小；K小，Rf大 阻滞因子Rf=溶质的移动距离/流动相在色谱系统中的迁移距离 阻滞因子定义：是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 4.吸附（定义、作用力、常见吸附剂及影响因素）、吸附薄层色谱、吸附柱色谱 吸附定义：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使 其富集在吸附剂表面的过程。 （表面吸附与吸收） 作用力： 吸附剂与吸附质间的范德华力（定向力、诱导力、色散力）或氢键。 常用吸附剂：活性炭、硅胶、大孔性吸附树脂、氧化铝 影响因素（1）吸附剂的