切向流过滤制备抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液及其质量评价

1、切向流过滤制备抗猪繁殖与呼吸综合征猪脾转移因子注射液及其质量评价随着我国规模化养猪业的发展,猪群饲养密度加大、免疫抑制病、饲料霉菌毒素等诸多原因导致猪群免疫功能低下,使猪群抵抗力差、疫苗免疫后不能产生有效保护,甚至免疫失败时有发生,让我国养猪业面临巨大风险。其中,猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是一种重要的免疫抑制性疾病,已造成严重的经济损失。我国主要以疫苗免疫来防控PRRS显示出一定效果，但至今我国PRRS勺防控依然面临巨大压力。为提高PRRS5苗免疫效力，PRRS5苗免疫佐剂的研发是一项重要工作。转移因子(T

2、ransferFactor,TF)是一种免疫增强佐剂,对于抗体或者抗生素控制不力的传染病及免疫缺陷疾病的预防起到重要作用。但目前国内兽用TF的生产均为非特异性TF(NonspecificTF，NTF)。在这不M#形下，抗PRRS特异性TF(SpecificTFagainstPRRS,PRRS-STF)的制造工艺及其质量评价将成为TF研发、生产的方向。基于此,本研究拟建立逐级切向流过滤技术生产PRRS-STF,t制备过程中的各项技术条件进行优化，为PRRS-STF勺大规模生产提供可靠的参考依据，并对应用该工艺制备的PRRS-STF进行质量评价。1.PRRS-STF勺制备及检验研究本试验从PRR凯

3、体阳性的免疫健康猪群，选取无牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRR则毒(PRRSV)口蹄疫病毒(FMDV伪狂犬病病毒(PRV)污染的猪脾脏，探索建立了PRRS-STF勺规模化制造工艺和特异性效力检验方法（白细胞粘附抑制法），并对实验室试制的3批等渗PRRS-ST进行了检验。结果显示,3批PRRS-ST多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力均较接近,分别达到2.5mg/mL以上、55g/mL以上、12%Z上和30%Z上；鉴别检验时PRRS-STF勺OD260nm/OD280S0

4、rtm值均大于1.9且均在250nm260nm处有最大吸收峰，内毒素含量均不超过10EU/mL;蛋白质定性检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验（包括BVDVPPVCSFVPCV-2、PRRSVFMDVPRV致细胞病变检验和红细胞吸附性外源病毒检验）结果均为阴性。结果表明,3批PRRS-ST具有抗PRRSI异性，其多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力等指标均远高于TF人医国家标准（转移因子注射液国家药品标准）和兽用现行最高质量标准（猪脾转移因子注射液质量标准（三类新兽药），且中性等渗、无灭活剂残留的工艺效果使PRRS-STFS于与PRRS活疫苗的联合免疫。2.PRRS-STF勺

5、切向流过滤工艺研究在生物制药中切向流过滤技术从纯化、澄清、浓缩到目标分子的分离均应用广泛,而TF的分离工艺是TF制备的关键技术。基于此，本试验通过0.1m20.22仙m切向流微滤和0.1m25KD切向流超滤研究膜透压（TMP）、进液流量、浓缩倍数和透析倍数等关键参数对膜通量（Flux）的影响，确定上述切向流工艺关键参数。并将参数线性放大于2m2微滤、2.5m2超滤系统制备5批PRRS-ST电传统Lawrence方法制备的5批PRRS-ST进行工艺过程、检验结果（性状、鉴别检验、蛋白质定性检验、多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力）对比。结果显示

6、，切向流过滤最佳条件为：进液流量、TMP浓缩倍数、透析倍数和平均Flux,在0.22仙m微滤时分别为9.3L/min/m2、2Psi、3倍、0.5倍和11LMH;在5KD超滤时分别为5L/min/m2、19.5psi、6倍、1倍和51LMH线性放大后的Flux曲线与0.1m2时接近。切向流过滤方法制备的PRRS-ST多肽含量、核糖含量、脱E受体法效力检验非特异性效力和白细胞粘附抑制法效力检验特异性效力均高于传统Lawrence方法,且用时减少24h左右。结果表明，切向流过滤方法线性放大良好、生产效率高，所制备PRRS-STFT效成分含量和活性高。3.PRRS-STF的除病毒工艺研究本试验采用不

7、同终浓度B-内内酯（0.1%、0.02%、0.01%、0.005%）对含有PPV的离心上清液（PPV终毒价为105TCID50/mL）进行不同时间（12h、24h、36h、48h）的灭活，灭活后样品经37c水解2h,采用猪睾丸ST细胞培养及三代盲传观察细胞病变，对第3代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体法检验灭活效果。结果显示，12h48h内,0.1%、0.02%?口0.01%0-丙内酯PPV佥验结果均为阴性;48h内,0.005%B-丙内酯PPV佥验结果为阳性。考虑确保产品的安全性，因此规定：终浓度为0.01%的B-丙内酯在28c下灭活24h,灭活后置于37c下水解2h。本试验还采用5KD超滤膜

8、对分别含有终毒价为106TCID50/mLPCV-2、PRRSV和PRV勺微滤透过物进行超滤，PCV-2组的超滤透过物采用猪肾PK-15细胞培养和三代盲传，对第3代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体法检测，而PRRSV1、PRV组的微滤透过物采用PCR!行检测。结果显示，PCV-2、PRRSVPRV佥验结果均为阴性。这些结果表明，B-丙内酯和5KD超滤膜等除病毒工艺确保了PRRS-ST比外源病毒污染。4.PRRS-STFI勺药理学研究本试验采用试制的3批PRRS-STF8行药理活性研究,结果显示,3批PRRS-STFS家兔热原检查、小鼠异常毒性检查和豚鼠过敏反应检查均合格；家兔E玫瑰花试验时实验组

9、E玫瑰花结百分率(23.3%、23.6%和26.2%)均显著高于对照组(13.2%)(P<0.05);小鼠迟发型变态反应试验时实验组月中胀度(14.3、14.5及15.8mg典显著高于对照组(9.8mg刖空白组(0.5mg)(P<0.05);小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验时实验组吞噬百分率(30.50%、30.83%、31.17%)及吞噬指数(0.68、0.67、0.71)均显著高于对照组(21.33%及0.45)(P<0.05);小鼠碳粒廓清试验时实验组巨噬细胞K均值(0.0455、0.0487、0.0492)及a均值(6.97、6.95、7.39)均显著

10、高于对照组(0.0263及5.97)(P<0.05)。结果表明，PRRS-STFW显著提高T淋巴细胞及巨噬细胞活性，促进T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，提高机体免疫功能。5.PRRS-STFI勺安全性研究本研究开展了PRRS-ST印独注射及与PRRSS疫苗联合免疫注射的安全性试验，对1日龄仔猪、46周龄保育猪、怀孕30天左右母猪、产前30天左右母猪和种公猪采用实验室试制的3批PRRS-ST分别进行一次单剂量、重复单剂量和一次超剂量单独肌肉注射。止匕外，还对34周龄仔猪、配种前1周左右母猪和种公猪进行了一次单剂量、一次超剂量的PRRS-STFfPRRS舌疫苗联合免疫肌肉注射。结果显示

11、,PRRS-STF单独注射及与PRRS舌疫苗联合免疫注射的仔猪、保育猪、母猪和种公猪均没有不良反应，注射PRRS-STF勺母猪分娩后产仔情况与非PRRS-STIS射组相比无差异，仔猪以及保育猪的平均日增重均高于非PRRS-STFi射组但差异不显著(P>0.05)表明PRRS-STF寸仔猪、保育猪、母猪和种公猪均安全。6.PRRS-STFI勺效力研究本试验通过PRRS-STF寸猪淋巴细胞转化率（MTT法检测）和E玫瑰花结百分率,PRRS舌疫苗免疫猪PRRS啦体水平（Elisa法才测）、IFN-丫含量（液相芯片平台技术LuminexX-MAPt检测）和外周血淋巴细胞（Lym）、T淋巴

12、细胞、CD4+CD8+双阳性T（DPT）淋巴细胞、CD4-CD8双阴性T（DNT）淋巴细胞数量及比值（流式细胞技术绝对与相对计数法）,PRRS活疫苗攻毒保护力的影响研究，对试制的PRRS-ST敢力进行评价。结果显示，单独注射PRRS-STFT提高猪淋巴细胞转化率和E玫瑰花结百分率，提高猪免疫功能；联合注射PRRS-STFT提高PRRSS疫苗（CH-1R株）免疫猪PRRSV抗体水平和IFN-丫含量，提高PRRSS疫苗的免疫效果。PRRS-STFT提高PRRS活疫苗（CH-1R株）攻毒保护力，对高致病性PRRSV（HighlyPathogenicPRRSV,HP-PRRSV）TJ-F5的攻毒保护率由单独免疫猪攻毒保护率40%!高到联合免疫猪攻毒保护率达80%。免疫后3d至21d实验组DPT细胞数量、DPT/T比值高于其他两组,而免疫后7d至21d实验组DNT细胞数量、DNT/T比值始终低于其他两组；攻毒后第3d,各组Lym、T、DPT和DNT细胞数量均显著降低（P<0.01）,此时各组Lym、T、DPT和DNT细胞数量和DPT/T、DNT/T比值分别为攻毒前均值的35%、38%、27%51%口72%134%;至攻毒后第28d,各组存活猪LymT、DPT和DNT细胞数量和DPT/T、DNT/T比值分别为攻毒前均值的72%、60%、122%、36%和197%、5