多天线癌胚抗原检测方法的建立及其在恶性肿瘤患者血清中的水平

1、论著文章编号:1007-8738(200406-0734-03多天线癌胚抗原检测方法的建立及其在恶性肿瘤患者血清中的水平张利军,刘树林,徐顺军(第四军医大学唐都医院检验科,陕西西安710038收稿日期:2003-11-28;修回日期:2003-12-28作者简介:张利军(1973-,女,山东曹县人,技师.T el :(02983577701;Email :pathol Establishm ent o f a m ethod to detect multi 2ple antennae carcinoembryonic antigen (MA 2CEAand MA 2CEA level in t

2、he sera of patients with malignant tumorsZH ANG Li 2jun ,LIU Shu 2lin ,XU Shun 2junDepartment of Clinical Laboratory Diagnosis ,T angdu H ospital ,F ourth Military Medical University ,X i an 710038,ChinaAbstractAIM :T o e stablish a rapid quantitative method to detect the serum multiple antennae car

3、cinomabrinic antigen (MA 2CEA ,and to mea sure the MA 2CEA levels in the sera of patients with malignant tumors.METH ODS :Neuraminida se (NMD wa s used to dige st the sialic acid at terminals of sugar chains of MA 2CEA ,and then the datura stramonium agglutinin (DSA and an 2ti 2CEA antibody were use

4、d to set up streptavidin 2biotin complex (ABC system EI A (ABC 2EI A for detecting serum MA 2CEA levels of 239patients with carcinoma s of lung ,stomach ,liver ,colon and ovary.The serum CEA level wa s determined by E LISA.RESU LTS :The level of serum MA 2CEA wa s remarkably elevated in the CEA 2po

5、sitive patients with lung cancer.The po s 2itive rate of MA 2CEA wa s 14.6%in 75patients with lung can 2cers ,and 47.3%in 19CEA 2po sitive patients with lung cancers.The MA 2CEA wa s not detected in the sera of other tumor pa 2tients.CONC L USION :We have developed a method for detec 2tion of MA 2CE

6、A levels ,which lays the foundation for the differ 2ential diagno sis of lung cancer and for re search on the other multiple antennae tumor markers.K eyw ords :multiple antennae sugar chain structure ;carcinoem 2bryonic antigen ;tumor marker摘要目的:建立多天线癌胚抗原(multiple antennae carcinoembry onicantigen ,

7、M A 2CE A 的快速定量检测法,并研究肿瘤患者血清中多天线癌胚抗原的水平。方法:采用神经氨酸酶(neuramin -idase ,NM D 降解M A 2CE A 糖链外侧的唾液酸。采用蔓陀萝凝集素(datura stram onium agglutinin ,DS A 和CE A 抗体,建立检测M A 2CE A 的链霉亲和素2生物素系统酶免疫分析法(ABC 2EI A ,分别检测239例肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者血清中M A 2CE A 的水平,同时采用E LIS A 检测血清CE A 的水平。结果:血清M A 2CE A 的水平在CE A 阳性的肺癌患者中明显升高,75例

8、肺癌患者血清M A 2CE A 的阳性率为14.7%,而CE A 水平升高的肺癌阳性率为47.3%;但胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者,无论CE A 水平是否升高,均未检测到M A 2CE A 水平的升高。结论:建立了一种可定量检测肿瘤患者血清M A 2CE A 的方法,为肺癌的鉴别诊断及其他多天线糖链肿瘤标志物的研究奠定了基础。关键词:多天线糖链结构;癌胚抗原;肿瘤标志物中图分类号:R544.12文献标识码A30多年的临床应用表明,癌胚抗原(carcinoem 2bry onic antigen ,CE A 对恶性肿瘤的特异性很差。近年CE A 主要作为恶性肿瘤复发转移的指标及对其生物半衰期的

9、意义进行了研究1,2。1990年,K abata 等发现,尿中人绒毛膜促性腺激素(HCG 的氨基酸序列及抗原性,在正常孕妇与绒癌患者之间完全相同,但具有3,42天线结构的HCG 在蔓陀萝凝集素(datura stram onium agglutinin ,DS A 层析柱上表现为强结合,而非癌性患者尿中的HCG 则不结合或弱结合。因此,在检测尿中HCG 时,由于蛋白部分相同而糖链结构不同,在DS A 柱上可表现出“质”的差异,而成为鉴别诊断绒癌与良性妇科病的特异方法。此后,国内学者用DS A 亲和柱层析法,对多天线碱性磷酸酶进行了较为深入地研究。结果表明,只有肝癌血清在DS A 柱上表现为强结

10、合325。我们认为,各种恶性肿瘤患者CE A 特异性较差的原因,可能是由于CE A 的糖链结构有别,从而对多天线癌胚抗原(multi 2ple antennae carcinoembry onic antigen ,M A 2CE A 的检测方法及其意义进行了研究。1材料和方法1.1材料链霉亲和素与生物素化蔓陀萝凝集素(DS A 购自美国Vector 公司。CE A 检测试剂盒为美国Bio2seed公司产品。神经氨酸酶(neuraminidase, NM D,购自上海生物化学研究所。美国伯乐450型酶标仪、洗板机为香港Denley Drag on公司产品。239例血清标本来自我院1999-10

11、2001-12期间的住院患者,均经手术、肠镜、胃镜或支气管镜等至少一项病理检查而确诊。1.2方法1.2.1SE A标准曲线的绘制采用CE A标准品按检测试剂盒中的说明书进行。主要步骤如下:采用包被液(2.5mm ol/L TrisCl及15mm ol/L NaCl, pH7.54将CE A标准品稀释至终浓度依次为3、12、30、60及120g/L。每个稀释度各取50L,加入到已包被抗CE A单克隆抗体(mAb的酶标板中,于37放置1h。以P BS洗板5次后,依次加入100L HRP标记的抗CE A mAb(于37放置1h,常规P BS 洗板、100L T M B显色液(室温显色15min及50

12、L终止液。反应后,用酶标仪于波长450nm读取A值,并绘制标准曲线。1.2.2肿瘤患者血清CE A的检测取肿瘤患者血清各100L,分别加入2L1000U/L神经氨酸酶(NM D,于37消化10min,以降解M A2CE A糖链末端的唾液酸。取50L NM D处理后的血清,加入到已包被抗CE A mAb的酶标板中,于37放置1h,以P BS洗板5次。以后的步骤完全同1.2.1。然后根据SE A的标准曲线,计算出血清CE A的水平(g/L,CE A 的水平>5.0g/L者为阳性。1.2.3肿瘤患者血清M A2CE A的检测采用ABC2E LA法检测肿瘤患者血清M A2CE A的水平。将以包被

13、液稀释的链霉亲合素(终浓度为100mg/L加入酶标板中,每孔100L,于4包被48h,以P BS洗板后,于4保存备用。取50L NM D处理后的血清加入到链霉亲和素包被板中,再加入10L5g/L生物素化的DS A,于37孵育1h。以P BS洗板5次后,加入100L HRP标记的抗CE A mAb,于37孵育1 h。同上洗板后,加100L T M B室温显色15min。终止后,用酶标仪于波长450nm读取A值,并根据CE A的标准曲线计算出血清M A2CE A的水平,M A2 CE A的水平>0g/L者为阳性。2结果2.1CEA标准曲线的绘制将不同浓度的CE A标准品用E LIS A进行测

14、定,根据各浓度CE A相应的A450值,绘制出CE A的标准曲线,其线性关系良好(图1 。图1CE A的标准曲线Fig1S tandard curve for CE A2.2肿瘤患者血清CEA与MA2CEA水平的检测75例肺癌患者中,血清M A2CE A水平升高者主要为CE A水平升高的病例,其中5例血清CE A的水平分别为36.6、166、157.4、103.9及98.4g/L;血清M A2CE A的水平分别为15.4、94.6、55.4、90.4及96.9g/L。但有2例肺癌患者血清CE A的水平分别为77.2、154.3g/L;而M A2CE A的水平均为0g/L。在肺癌患者中,血清M

15、A2CE A的检出阳性率为14. 6%,其中在CE A阳性的肺癌患者中,其阳性检出率占47.3%;而在胃癌、肝癌、结肠癌与卵巢癌患者的血清中均未检出M A2CE A(表1。表1恶性肿瘤患者血清CE A与M A2CE A的水平和检出阳性率T ab1The levels and detectable positive rates of serum CE A and M A2CE A in patients with malignant tum ors(x±s,g/L Tum or patients nCE ALevelP ositiverate(%M A2CE ALevelP ositi

16、verate(% Lung cancer7514.3±35.525.317.5±35.214.6bStomach cancer44 3.9±6.215.900Liver carcin oma57 5.1±13.112.300C olon cancer3512.3±2.528.600Ovarian cancer28 3.1±2.710.700b P<0.01vs4other tum or patients.3讨论众多研究表明,在恶性肿瘤患者的组织和血清中,糖蛋白中N2糖链的结构可出现多种不同的变化,很可能是糖链加工酶活性改变所致6

17、,从而造成糖蛋白分子间质的差异,这种差异可用特异性识别各种糖基序列的凝集素检出。其中DS A同单天线和2, 222天线复杂型N2糖链不结合,而与具有2,2,623天线或2,4,2,624天线及G al21,4G LC NAC21,3重复顺序的N2糖链可强结合。另外,也能同具有2,42偏2天线或2,4,223天线的N2糖链结合7。由于糖链外侧的唾液酸可影响糖链与DS A的结合,故在检测时需用NM D水解糖链外测的唾液酸。本研究中我们利用糖链能够与DS A结合的特点,建立了检测血清M A2CE A的E LIS A方法。并检测了多种恶性肿瘤患者血清M A2CE A与CE A的水平。结果发现,部分CE

18、 A水平升高的肺癌患者血清中M A2CE A的水平也升高,但其他肿瘤患者的血清中,均未发现有M A2CE A水平升高。同样,在肺癌和其他肿瘤患者的血清中,均未发现M A2CE A水平升高而CE A水平正常的病例。这一结果为研究肿瘤的标志物与恶性肿瘤的关系,提供了一定的依据。值得一提的是,最初作为结肠癌标志物的CE A,在本研究中其升高的幅度并不大。35例结肠癌患者中,有10例血清CE A的水平升高,最高为17.7g/L,2例分别为2.7和8.5g/L,但血清C A242的水平分别高达160.4g/L和367.6g/L,无1例可检出血清M A2CE A,提示检测C A242的生物半衰期,对判定结

19、肠癌的复发与转移更有意义8。至于M A2CE A是否可作为肺癌诊断的理想指标,尚需大量的临床病例加以佐证。参考文献:1刘树林,齐为民,张丽君,等.癌胚抗原生物半衰期检测恶性肿瘤的评价J.第四军医大学学报,2001,22(10:926-928.2赵青,陶莎,杨洁,等.CE A2rV对小鼠巨噬细胞抗原呈递功能的影响J.细胞与分子免疫学杂志,2002,18(5:421-423.3Lu Y,Lu Q,Chen H L.Diagnosis of primary liver cancer using lectin affinity chromatography of serum alkaline phos

20、phatase J.J Exp Clin Cancer Res,1997,16(1:75-80.4郭子林,马玉玲,吴福国,等.原发性肝癌型碱性磷酸酶凝集素亲和层析测定及临床意义J.中国慢性病预防与控制,2002,10(1:17-19.5付红梅,吕元.肝癌标志物人肝癌组织中碱性磷酸酶糖链结构分析J.上海医学检验杂志,1999,14(3:165-168.6Y amashita K,T otani K,Ohkura T,et al.Carbohydrate binding properties of com plex2type olig osaccharides on imm obilized da

21、tura stram onium lection J.J Biol Chem,1987,262:1602-1607.7Lu Y,W old F.Regulation of glycan processing by G olgi enzymes from red kidney bean(Phaseolus vulgarisseedlings J.Arch Biochem Biophys, 1991,286(1:147-152.8于文彬,陈名声,张小宁,等.血清CA242,CA50和LN水平与大肠癌转移及病理分期的关系J.第四军医大学学报,2000,21(10:1238-1240.(上接733页能

22、恢复的标志。本例研究中血清甘油三脂从0.11mm ol/L逐渐升至1.75mm ol/L,胆固醇从1.52mm ol/L升至6.14mm ol/L。总蛋白从43g/L逐渐升至76.8g/L,白蛋白从19.8g/L升至47.6g/L,表明小肠功能良好。但在急性免疫排斥反应时,上述指标也出现下降,按急性排斥反应治疗后,又逐渐上升。所以也是急性排斥反应时的1个信号。1999-11-22 (67d肝功能的T Bil、GG T、A LP和血清白蛋白再次升高和降低,按急性免疫排斥反应治疗后,试验结果也逐渐恢复正常范围,说明这些指标对急性免疫排斥反应有一定的临床诊断和治疗的意义。小肠吸收率试验D2木糖从25.6%降至16. 8%。血细胞分析显示:典型嗜酸性粒细胞为0.08,反应性嗜酸性粒细胞为0.26,