植物细胞工程中国药科大学生物工程所有ppt课件

1、 第四章 植物细胞工程 Plant Cell Engineering 第一节 概述掌握植物细胞工程根本概念 及其主要内容 运用了解植物细胞工程的研讨简史、现状 及开展前景 热点植物细胞工程的开展历史德国植物学家 Haberlandt 植物细胞培育开创人1902年根据细胞学说 cell theory 提出植物体细胞有再生完好植株的潜在全能性-细胞全能性totipotency 植物细胞全能性是植物细胞工程的实际根底 1904年，德国植物胚胎学家Hanning 用萝卜和辣根的胚进展离体培育，提早长成了小植株，初次获得胚培育胜利。 成熟 发芽 常规：幼胚 种子 植物 培育 组织培育： 幼胚 植株 19

2、22年，Knudson 对兰花幼胚进展培育获得幼苗，抑制了兰花种子发芽难的困难。 1925年，Laibach 进展亚麻种间杂种幼胚培育，胜利地得到了杂种植物。 1934年，White 等用番茄根尖的组织培育，建立了第一个活泼生长的无性繁衍系。 1934年，Gautheret 培育山毛柳、黑杨的构成层组织，获得愈伤组织构成。 1937年，White 和Went 等分别发现B族维生素和吲哚乙酸IAA对培育的离体根生长具有重要作用。 1937-1938年，Gautheret 在1934年培育山毛柳、黑杨胜利获得愈伤组织的根底上，在培育柳树的培育基中，参与IAA 和B族维生素等，使构成层的生长大为添加

3、。 1937-1938年，Nobecourt 培育胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培育基上继续培育，可无限发生细胞增殖，构成愈伤组织。初次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培育物。 White、Gautheret、Nobecourt 等科学家被誉为植物组织培育的奠基人。 在此根底上建立了植物组织培育的综合培育基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激要素。这是随后创建的各种培育基的根底，同时也建立了植物组织培育的根本方法，成为当今各种植物组织培育的技术根底。一一.植物细胞工程根本概念：植物细胞工程根本概念： 原理和方法：细胞学、生理学、分子生物学及工程学原理 对象：植物

4、细胞 设计改造：植物细胞遗传性 目的：发明新物种，提供名贵药品及效力二二.植物细胞工程研讨主要内容植物细胞工程研讨主要内容 ： 植物细胞和组织培育技术 原生质体培育和交融技术 植物的快速繁衍和人工种子 植物染色体工程 转基因技术 植物细胞工程植物细胞工程 热点热点 1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培育技术培育植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。 2.采用植物的遗传操作技术改动植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，消费有药用价值的次生代谢产物。第二节 植物细胞培育特性 及主要培育技术 细胞的全能性: 一个细胞具有产生完好生物个体的固有

5、才干。一、重要概念一、重要概念植物干细胞：植物胚性细胞embryogenic cells即合子。分化的根茎叶中仍保管少数未分化或分化程度不高的细胞遗留的胚性细胞一、重要概念一、重要概念细胞的脱分化dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动方式发生变化，改动原有的发育途径，失去原有的分化形状，转变为具分生才干的胚性细胞。已分化细胞要表现全能性，先要脱分化成分生细胞，后再分化构成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。一、重要概念一、重要概念外植体(explant)：植物体上取出的用于培育和分别细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组

6、织，又是脱分化细胞次生代谢产物：坚持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。一、重要概念一、重要概念一、重要概念一、重要概念 植物组织培育植物组织培育 在无菌条件下，将离体的植物器官在无菌条件下，将离体的植物器官(如根如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等子等)、组织、组织(如构成层、花药组织、胚如构成层、花药组织、胚乳、皮层等乳、皮层等)、细胞、细胞(如体细胞、生殖细如体细胞、生殖细胞等胞等)、胚胎、胚胎(如成熟和未成熟的胚如成熟和未成熟的胚)、原、原生质体生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质如脱壁后仍具有生活力的原生质体体)，培育在人工培育基上，

7、给予适宜的，培育在人工培育基上，给予适宜的培育条件，诱发产生愈伤组织，或埋伏培育条件，诱发产生愈伤组织，或埋伏芽等，或长成完好的植株，芽等，或长成完好的植株， 又分为植株培育、胚胎培育、器官培育、又分为植株培育、胚胎培育、器官培育、组织培育、原生质体培育等。组织培育、原生质体培育等。 延迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成才干；加速期：细胞快速生长期。细胞数、DNA和蛋白质浓度添加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成才干减少；对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停顿期之间。添加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成才干完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化

8、及高浓度有机化合物。二、培育植物细胞二、培育植物细胞 四个生长时期四个生长时期 1植物细胞有独特的培育时间及特征：分量的添加在对数期，次生代谢产物积累在稳定期2植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。3植物细胞好气，培育过程需供气及搅拌，4植物细胞较微生物细胞大得多，纤维素细胞壁，细胞壁脆弱，抗剪切才干小，传统的搅拌式反响器极易损伤细胞壁三、植物细胞的培育特点三、植物细胞的培育特点 5具有群体效应、无锚定依赖性及接触抑制性；6培育细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；7培育过程具有构造与功能全能性。经过增殖与分化，能发育成为植株 三、植物细胞的培育特

9、点三、植物细胞的培育特点1必需元素大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等2无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。3碳源，蔗糖4需多种维生素烟酸，B1，B6和植物生长激素 生长素，细胞分裂素，赤霉素，零落酸，乙烯。5需有机物：甘氨酸或水解络酪蛋白，酵母提取液等。四、植物细胞营养要求四、植物细胞营养要求A B A：BA(0mg/L) ，芽减少，根增多愈伤组织一定量B：BA(0.1mg/L)，芽适量，根适量愈伤组织一定量A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽少，根无，芽少，根无 B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽少，根无，愈伤组织少量，芽少，根

10、无，愈伤组织少量 C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽少，根多，愈伤组织一定量，芽少，根多，愈伤组织一定量A B C 常用培育基MS、N6、B6、RM-1964、 KM-8p等。MS培育基是目前运用最多最普遍的培育基。无机盐的浓度较高，能保证组织培育生长所需的矿物营养。五、植物细胞培育基五、植物细胞培育基贮备液母液的配制贮备液母液的配制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？ 1、方便、方便 2、准确有些成分量太小、准确有些成分量太小 以以MS培育基配制为例：培育基配制为例：1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1 1培育基浓度含量扩展培育基浓

11、度含量扩展1010倍，按顺序逐渐倍，按顺序逐渐混合。后用蒸馏水定容到混合。后用蒸馏水定容到1000ml1000ml的容量瓶中，即为的容量瓶中，即为1010倍倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保管于冰箱中。的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保管于冰箱中。配制培育基时，每配配制培育基时，每配1L1L培育基取此液培育基取此液100ml100ml。 留意：留意：(1) (1) 某些无机成分如某些无机成分如Ca2+Ca2+、SO42SO42一、一、Mg 2Mg 2十和十和H2PO4H2PO4一等在一同能够发生化学反响，产生沉淀物。为一等在一同能够发生化学反响，产生沉淀物。为防止此景象发生，母液配制

12、时要用纯度高的重蒸馏水溶防止此景象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必需先解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必需先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才干混合，混合时应留以少量重蒸馏水使其充分溶解后才干混合，混合时应留意先后顺序。特别应将意先后顺序。特别应将Ca2+Ca2+、SO42SO42一、一、Mg 2Mg 2十和十和H2PO4H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl22H2O(2)CaCl22H2O要在最后单独参与，在溶解要在最后单独参与，在溶解CaCl22H2OCaCl22

13、H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2CO2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaCl22H2OCaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。作时要防止其溢出。、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培育基的微量元素无机盐由培育基的微量元素无机盐由7 7种化合物除种化合物除FeFe组成。组成。微量元素用量较少，特别微量元素用量较少，特别是是 CuSO45H2O CuSO45H2O、 CoCl26H2O CoCl26H2O ，因此在配制中分微，因此在配制中分微量量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，用感量

14、为配方，用感量为0.0001g0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培育基时，的分析天平称量，其它同大量元素。配制培育基时，每配制每配制1L1L培育基，取微量培育基，取微量10ml10ml，微量，微量mlml3 3、铁盐母液的配制、铁盐母液的配制铁盐不是都需求单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和铁盐不是都需求单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一同配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸大量元素一同配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必需单独配成母亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必需单独配成母液。这种螯合物运用起来方便，又比较稳定，不易发液。这种螯合物运用起

15、来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培育基时，配制配制培育基时，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。在配制铁盐时，假设加热搅拌时间过短，会呵斥在配制铁盐时，假设加热搅拌时间过短，会呵斥Fe S 04和和Na2EDTA鳌合不彻底，此时假设将其冷藏，鳌合不彻底，此时假设将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为防止此景象发生，配制铁盐会结晶析出。为防止此景象发生，配制铁盐母液时，母液时，Fe S 04和和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色并置于

16、加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加约加热热20 - 30 min)，调，调pH值至值至5 .5，室温放置冷却后，室温放置冷却后，再冷藏。再冷藏。4 4、有机母液的配制、有机母液的配制MSMS培育基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐培育基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培育基中的有机成分原酸硫胺素和盐酸吡哆素。培育基中的有机成分原那么上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，那么上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，留意称量时用电子分析天平。并储存在棕色无菌留意称量时用电子分析天平。并储存在棕色无菌瓶中瓶中 。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、叶

17、酸，用稀氨水溶解，然后定容。 5 5、植物生长调理剂母液配制、植物生长调理剂母液配制普通植物生长调理剂母液的配制的终浓度以普通植物生长调理剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml0.5mg/ml为好，需求留意的是：为好，需求留意的是：配制生长素类，例如配制生长素类，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，应先用少量应先用少量95%95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。以后者效果好。细胞分裂素，例如细胞分裂素，例如

18、KTKT，应先用少量，应先用少量95%95%乙醇或乙醇或无水乙醇加无水乙醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的盐酸溶解，或直接用的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，再用蒸馏水定容。溶解，再用蒸馏水定容。GA3GA3以以95%95%酒精溶解不耐高温，过滤灭菌酒精溶解不耐高温，过滤灭菌保管在棕色试剂瓶中。保管在棕色试剂瓶中。留意：留意：一切母液都要贴上标签，注明称号、配制倍数、一切母液都要贴上标签，注明称号、配制倍数、日期，一切的母液都应保管在日期，一切的母液都应保管在04冰箱中，假冰箱中，假设母液出现沉淀或霉团那么不能继续运用。设母液出现沉淀或霉团那么不能继续运

19、用。 White的无机盐含量较低，适于生根培育。KM-8p主要用于原生质体培育，含几乎一切单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡花药培育中常用培育基，成分较简单， 且KN03和(NH)2N04含高。五、植物细胞培育基五、植物细胞培育基培育基的配制培育基的配制 1 1、计量、计量 根据配制培育基的量和母液的浓度计算需求汲取母液根据配制培育基的量和母液的浓度计算需求汲取母液的量，计算公式：汲取量的量，计算公式：汲取量 ml=ml=培育基中物质的含量培育基中物质的含量mg/Lmg/L1000ml/1000ml/母液浓度母液浓度mg/Lmg/L。2 2、移液、移液取烧杯一只，参与少量的蒸馏水，按照计

20、算汲取母液取烧杯一只，参与少量的蒸馏水，按照计算汲取母液的量依次汲取各母液置于烧杯中备用。的量依次汲取各母液置于烧杯中备用。3 3、称取琼脂蔗糖备用、称取琼脂蔗糖备用4 4、融化、融化用量杯量取用量杯量取600600700ml700ml的蒸馏水放在电炉上，参与的蒸馏水放在电炉上，参与琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，参与蔗糖。状将其取下，参与蔗糖。大烧杯底的外外表不能沾水，否那么加热时烧杯容大烧杯底的外外表不能沾水，否那么加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，呵斥烫伤。易炸裂，使溶液外溢，呵斥烫伤。 5 5、混合、混合将融化的琼脂和母

21、液充分混合，用蒸馏水定容到将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml1000ml，来回混合几次。，来回混合几次。6 6、调、调pHpH用滴管汲取物质的量浓度为用滴管汲取物质的量浓度为1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，溶液，逐滴滴入溶化的培育基中，边滴边搅拌，并随时用精逐滴滴入溶化的培育基中，边滴边搅拌，并随时用精细的细的pHpH试纸试纸(5.4(5.47.0)7.0)测培育基的测培育基的pHpH，不断到培育基，不断到培育基的的pHpH到达要求为止到达要求为止( (在调制时要比目的在调制时要比目的pHpH值偏高值偏高0.20.20.50.5个单位，

22、由于培育基在灭菌过程中由于糖等物质的个单位，由于培育基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，降解，pHpH值会下降值会下降0.20.20.50.5个单位左右个单位左右) )。7 7、分装、分装溶化的培育基应该趁热分装。留意不要让培育基沾溶化的培育基应该趁热分装。留意不要让培育基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培育基的量约为锥形瓶到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培育基的量约为锥形瓶容量的容量的1/51/51/41/4。每。每1L1L培育基，可分装培育基，可分装20203030瓶。瓶。8 8、包扎、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上

23、写上培育基的代号。用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培育基的代号。9 9、培育基的灭菌、培育基的灭菌 一植物细胞的获得1.外植体直接分别法:机械切割、组织破碎2.愈伤组织分别法：制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处置外植体或愈伤组织，分别原生质体，再生培育基中培育，原生质体细胞壁再生。六、植物细胞的培育技术六、植物细胞的培育技术 1.单细胞的培育1看护培育法nurse culture：在单细胞的生长环境里参与愈伤组织同时培育。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传送生物信息，使细胞分裂增殖。即愈伤组织看护单细胞适用于难于培育的植物种类 二植物细胞的培育方法二植物细胞的培育

24、方法 2微室培育法：单细胞悬液接种到人工制造一个小室如凹玻片与盖玻片组成的微室，内含少量培育基，密封培育，使其分裂增殖构成细胞团的方法 延续察看，通气性差 1.单细胞的培育单细胞的培育 3平板培育法：将制备好的单细胞悬液，按一定的细胞密度，接种于固体培育基上，或与融化的琼脂培育基均匀混合，并平铺一薄层在培育皿底上的培育方法 每个平板上构成的细胞团数植板率%=- 100% 该平板上接种的细胞数1.单细胞的培育单细胞的培育 4条件培育法：接种于条件培育基上构成的细胞系条件培育基：培育过细胞的培育基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培育基。1.单细胞的培育单细胞的培育指将植物单倍体细胞花药培

25、育成单倍体植株或经过染色体加倍成纯二倍体植株。花药培育的根本程序是：外植体(花蕾)选择预处置花蕾消毒取花药接种诱导培育分化培育2.单倍体细胞的培育花药培育单倍体细胞的培育花药培育3.愈伤组织培育愈伤组织培育愈伤组织，为脱分化细胞，具再分化的才干，可培育用于次生代谢物的消费，或再生为植株。 (cell suspension culture)游离植物细胞悬浮于液体培育基中振荡培育，细胞总数不断添加，产量达最高点后生长趋于停顿，然后进展移植继代培育 方法4细胞悬浮培育法细胞悬浮培育法 单细胞悬浮0.251050.5105细胞/ml, 枯燥保管法、液体石蜡覆盖法、低温保管法低压低氧保管法超低温深冻保管

26、法 七、种质保管七、种质保管 超低温深冻保管法 资料：愈伤组织、悬浮培育细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞胚状体、茎尖分生组织、小植株及茎芽 -196液氮冰冻维护剂 二甲亚砜DMSO、甘油、山梨糖及蔗糖等，复合成分较单一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍左右。七、种质保管七、种质保管 第三节原生质体培育第三节原生质体培育 和交融技术和交融技术 指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的且具有生活力的裸露细胞。一、原生质体的概念一、原生质体的概念二、原生质体培育技术二、原生质体培育技术用酶除去植物体细胞的细胞壁，获得原生质体。原生质体在良好的培育基上生长分裂，细胞壁再生，

27、构成愈伤组织，诱导愈伤组织分化，长出茎、叶，根而构成植株。一资料预备一资料预备 无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培育细胞二原生质体的制备二原生质体的制备 1，酶处置 纤维素酶类 半纤维素酶 果胶酶类 酶溶剂：原生质体培育基或特殊配制。 浸透压调理剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 2，原生质体的搜集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖 沉淀法： 常用甘露醇作为浸透压调理剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。 Percoll一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。 二原生质体的制备二原生质体的制备 目测法：在显微镜下察看，根据细胞形状、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA二乙酸荧光素是一种非极

28、性物质，能自在地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光荧光素，荧光素不能自在经过质膜。 伊凡蓝法：质膜遭到严重损坏使细胞被染色三原生质体活力检测三原生质体活力检测 1.液体浅层培育2. 固体培育3.液固 双层培育4.琼脂糖珠培育 四原生质体培育方法四原生质体培育方法等渗培育基或体细胞种子 概念 任何一种离体繁衍体包埋在含有营养成分和维护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗，发育成完好的植株，均可称之为人工种子。 第一类是裸露的或休眠的繁衍体，适当枯燥的体细胞胚、休眠的微鳞茎和微块茎等 第二类为人工种皮包被的繁衍体，一些体细胞胚、原球茎等 海藻酸钠作包埋 第三类是水凝胶包埋再包被人工种

29、皮的繁衍体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等 人工种子人工种子 细胞分裂与细胞壁再生 愈伤组织构成 愈伤组织分化 植株再生五、愈伤组织构成和植株再生五、愈伤组织构成和植株再生1.提高变异频率，提高变异频率，2. 细胞工程技术进展遗传重组的资料，细胞细胞工程技术进展遗传重组的资料，细胞交融和基因转移必需在原生质体上进展。交融和基因转移必需在原生质体上进展。 五、原生质体培育五、原生质体培育 意义意义 1、 直接挑选法 有新表型或感观上出现可测定的差别进展选择的方法 2、间接挑选法 用与突变表现型具有某种相关的特性为目的挑选 硝酸复原酶缺陷型细胞突变体，培育基参与氯酸盐，酶作用下产生次氯酸， 3、绿

30、岛法 在植株上使叶面细胞产生突变并发明选择压力，令抗性突变细胞正常生长构成绿色斑点，谓之“绿岛，切下绿岛即是突变细胞，经分散和培育后即可分化为完好突变植株， 三、细胞突变体挑选技术三、细胞突变体挑选技术 体细胞杂交一 类型 两大类： 对称交融asymmetric fusion两个完好的细胞原生质体交融。 非对称交融symmetric fusion利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进展交融。核失活 X射线，碘乙酰胺IOA、碘乙酸质失活罗丹明R6G，抑制线粒体氧化磷酸化。四、原生质体交融技术四、原生质体交融技术 1资料预备资料预备2原生质体的制备原生质体的制备3交融方法交融方法 PEG

31、，电交融，电交融4杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定二二.交融过程交融过程 3交融方法交融方法 PEG，电交融，电交融二二.交融过程交融过程按比例混合双亲原生质体滴加 PEG摇匀静置滴加高钙高pH液，摇匀静置滴加原生质体培育液洗涤数次离心得原生质体细胞团挑选再生杂合细胞。 1杂种细胞的选择杂种细胞的选择系统系统外观选择外观选择互补选择互补选择荧光标志选择荧光标志选择4. 杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定 2 体细胞杂种的鉴定 形状鉴定：根据双亲的形状学性状察看进展鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定

32、：RFLP鉴定、RAPD标志鉴定。4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定 RFLP 基因型之间限制性片段长度的差别 RAPD 建立在PCR根底之上的一种可对整个未知序列的基因组进展多态性分析的分子技术 4 杂种细胞选择系统与杂种植杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定株的鉴定原生质体培育13天，细胞壁再生 再生细胞一旦分裂，继续生长1 构成细胞团，发育成 愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完好植株 ；2 构成胚状体，再产生植株； 5、细胞壁再生愈伤组织构成和、细胞壁再生愈伤组织构成和植株再生植株再生 1、 植物育种中的核质交换2、 细胞质杂种的获得3、 远缘杂交发明新物种4、 细胞器的互作研讨三、交融技术运用三、交融技术运用第四节第四节 植物转基因技术植物转基因技术 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染将目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，然后经过细胞和组织培育技术再生出转基因植株 .转基因植物Transgene plant利用植物遗传工程进展DNA重组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。 一 植物转基因技术1 消费抗体、重组疫苗和多肽