神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

1、神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病的实验研究                                           作者：黄镇，衣昕，田美玲，秦建兵

2、60;  【摘要】  目的：观察神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病（AD）模型的效果以及神经元分化的情况。方法：体外分离培养大鼠胚脑神经干细胞，用纤维蛋白凝胶为支架移植入穹隆海马伞切断AD模型鼠海马，行为学测试后用免疫组织化学方法检测神经干细胞存活和分化情况。结果：支架组动物行为学的改善明显好于单纯干细胞移植组，支架组神经干细胞的存活和分化为神经元的情况均明显好于单纯干细胞移植组。结论：将纤维蛋白凝胶支架应用于神经干细胞的移植能促进干细胞的存活和分化。 【关键词】  阿尔茨海默病；神经干细胞；纤维蛋白凝胶支架；移植；大鼠  

3、0; Abstract   Objective: To observe the effect of transplanting neural stem cells and fibrin glue (FG) to treat AD model rats and the differentiation of neurons.  Methods: We transplanted neural stem cells from embryobrain of rats in hippocampi of AD model rats transecting fimbria for

4、nix with or without FG. 30 days after transplanting, test these AD models' behavior then inspect living and differentiation of NSCs by immuno -fluorescence.  Results: Significant behavior improvement was observed in FG group and single NSCs group, but FG group is better than single NSCs gro

5、up.The survival and effect of transplanting neural stem cells in FG group is superior than in single NSCs group.  Conclusion: FG can improve the survival and effect of transplanting neural stem cells.    Key words   Alzheimes disease; Neural stem cells； Fibrin glue； Tra

6、nsplanting； Rat    阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD），也称早老性痴呆，是一种以记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的中枢神经系统退行性疾病之一。直至今日仍未能找到有效的治疗AD的方法。神经干细胞研究为这类疾病的治疗开辟了一个新的方向。目前，国内外有关神经干细胞治疗PD的报道非常多并且都获得了较好的疗效1-3，而对神经干细胞移植治疗AD的研究报道则较少4。直接将细胞注入损伤部位难以使细胞保持良好的生长状态，不利于细胞黏附于受损部位的组织进行分化和增殖，选择适当的细胞支架是移植成功的一个关键因素。纤维蛋白胶(fibri

7、n glue, FG)是一种天然材料,资源丰富,生物相容性好,具有刺激未分化的间充质细胞增殖、促进毛细血管增生和长入的作用。本研究在体外分离培养大鼠胚脑神经干细胞，用纤维蛋白凝胶为支架移植入穹隆海马伞切断AD模型鼠海马，探讨纤维蛋白凝胶为支架移植神经干细胞对AD的治疗作用，为神经干细胞移植治疗AD奠定理论基础。    1   材料与方法    1.1   实验动物及试剂   Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重220240 g，雌性，由南通大学实验动物中心提供。DM

8、EM、F12培养基，B27，胎牛血清（Gibco公司）。碱性成纤维细胞生长因子，FG，Hoechst33342，结合FITC的山羊抗小鼠IgG（Sigma公司）。小鼠抗微管相关蛋白-2单克隆抗体（MAP-2）（Chemicon公司）。    1.2   方法    1.2.1   制作AD模型鼠及行为学检测   220240 g SD 大鼠若干只,雌性，麻醉后固定于立体定位仪，暴露前囟,记录前囟坐标A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）。根据Paxinos 图谱确定右侧穹窿

9、海马伞的切割范围，在颅骨上确定两点即A1=-1.4、L1=-1和A2=-1.4、L2 =-4，将两点间的颅骨划开一条骨缝，针刀插入脑内至切割深度V1.2=5.4，左右来回切割3 次，退出针刀，待无颅内出血后缝合皮肤，肌注青霉素。术后30天起进行避暗回避试验和跳台试验，测试仪器和方法同施碧涛等5报道。    1.2.2   神经干细胞体外分离培养和Hoechst33342标记   孕15天的SD大鼠腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent麻醉后，取胚鼠前脑室下带组织剪碎后胰酶消化。用毛细吸管机械吹打均匀，经200目不锈钢筛网过滤，

10、台盼蓝染色计数后接种至培养瓶并添加bFGF，然后置于37 、5%CO2培养箱中培养。每6天克隆传代1次。向传至第3代干细胞培养液中加入Hoechst33342，终浓度为5 g/ml，培养箱中培养1小时后，自然沉淀10分钟，弃上清，用无血清培养基清洗3遍，加无血清培养基10 ml，同时加入bFGF，置5% CO2培养箱中培养2天后可供移植。    1.2.3   神经干细胞移植和移植后行为学检测   将标记有Hoechst33342的神经干细胞球收集后用胰酶消化和毛细吸管机械吹打制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数后分2管：1管加入

11、纤维蛋白凝胶，另1管加无血清培养基，均调整细胞浓度至1×105个/l左右。将行为学检测成功的AD模型鼠麻醉后固定于立体定位仪上，切开皮肤，分离颅骨骨膜，钻孔。用微量进样器吸取神经干细胞悬液注射至两侧海马齿状回，每侧注射2.5 l。支架组注入加纤维蛋白凝胶的神经干细胞悬液，单纯干细胞移植组注入不加纤维蛋白凝胶的神经干细胞悬液，假手术组注入生理盐水。移植完毕后用骨蜡封闭颅孔，缝合切口，肌注青霉素10万U。术后30天起进行避暗回避试验和跳台试验，测试仪器和方法同上。    1.2.4   动物灌注、冰冻切片   各组动物

12、行为学检测完毕后麻醉，开胸经心灌注生理盐水100 ml及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.2） 400 ml，取脑后固定6 h。再分别经20%、30%蔗糖平衡，行冠状位冰冻连续切片。挑取带有移植区（假手术组挑取针道处）的切片，贴于涂布多聚赖氨酸的载玻片上。                            

13、;     1.2.5   Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标检测   将上述挑取的带有移植区的一套切片置于0.01mol/L PBS缓冲液（pH7.2）中漂洗3遍后，置入含有10%山羊血清的封闭液中，2小时后加1200稀释的小鼠抗MAP-2单抗，放入4 冰箱中过夜。次日晨吸去一抗，用PBS清洗3遍后，加入1100稀释的结合有FITC的山羊抗小鼠二抗，避光、室温下轻轻振摇2小时。用PBS清洗3遍后，甘油磷酸缓冲液封片。分别在激发光波长为346 nm、吸收光波长为460 nm和在激发光波长为495 nm

14、、吸收光波长为520 nm的荧光显微镜下观察Hoechst33342和MAP-2阳性的免疫荧光细胞并摄片。    1.2.6   统计学方法   采用Stata7.0统计软件，对各组动物移植前后避暗回避试验和跳台试验结果进行t检验。    2   结      果    2.1   行为学检测   FG支架组、单纯干细胞移植组和假手术组移植前、后避暗回避试验

15、及跳台试验检测数据及统计分析详见表1。FG支架组移植前、后的探索次数、滞留时间、主动回避和总回避阳性率相比P均<0.01，说明移植前、后大鼠的行为有显著性差异，学习和记忆能力有明显的改善。单纯干细胞移植组移植前、后的探索次数、滞留时间和主动回避阳性率相比P均<0.01，而总回避阳性率相比P 0.01，说明该组移植前、后大鼠的行为有改善，但差于FG支架组。假手术组移植前、后的探索次数、滞留时间、主动回避和总回避阳性率相比P均0.01，说明移植前、后大鼠的行为没有显著性差异，AD模型鼠并没有随着饲养时间的延长而自愈。    2.2  

16、神经干细胞移植后Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标检测结果   FG支架组和单纯干细胞移植组均有少量Hoechst33342（蓝色）与MAP-2（绿色）免疫荧光双标阳性细胞，提示移植的神经干细胞有部分能够分化成神经元。平均每视野Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标阳性细胞数：单纯干细胞移植组为4.16±0.19个；FG支架组为9.39±0.44个。FG支架组的免疫荧光双标阳性细胞（图1）明显多于单纯干细胞移植组（图2）。假手术组无双标阳性细胞发现。    3   讨 &

17、#160;    论    纤维蛋白黏胶是一种天然的细胞外基质，生物相容性、可塑性、可降解性良好，无细胞毒性，制备方便，近来越来越受到人们的关注。FG是纤维蛋白单体，是在凝血酶、氯化钙作用下聚合成的可塑形的、可黏附的和可降解的一种低抗原性的生物大分子材料，早已在临床上广泛使用，如止血、吻合口瘘的防治、促进伤口愈合、封闭体内空腔和蛛网膜下腔等6。纤维蛋白能较好的介导细胞间信号传导及其相互作用。纤维蛋白单体聚合成凝胶时，通过释放血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF-)，促进细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成7。总之，通过外源

18、性神经干细胞植入或内源性神经干细胞激活来弥补由于神经元受损而变性或死亡导致的神经功能的减退是目前神经疾病治疗的新途径。选择适当的体外扩增条件，可增加神经干细胞的来源，理想的细胞支架是移植研究的重点，决定着移植后细胞的生存率和生存状态。    本实验用纤维蛋白凝胶为支架将神经干细胞移植入穹隆海马伞切断的AD模型鼠海马，行为学结果证实明显好于单纯干细胞移植AD动物，免疫组织化学的方法进一步证实通过FG支架移植的神经干细胞较单纯移植的神经干细胞较多地分化成了神经元。目前尚未见到类似的报道，上述研究结果为以后临床上应用神经干细胞移植治疗AD奠定基础。【参考文献】  1 Sun ZH, Lai YL, Zeng WW, et al. Neural stem/progenitor cells survive and differentiate better in PD rats than in normal rats J. Acta Neurochir Suppl， 2003,87（2）: 169-174.2 Yang M, Stull ND, Berk MA, et al. Neural stem cells spontaneously express dopaminergic traits after tr