血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳

1、实验四 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳【原 理】聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理在(电泳法)总论中已作详述。本实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应，电荷效应，分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成57个组份，而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出1230个组份，【操作】(一)、凝胶柱的制备1、取已准备好的10×0.6cm的玻管，从一端量至7cm处，用玻璃腊笔划线。起始端用胶布包封好后。插入橡皮塞中，垂直放好。2、分离胶的制备：(1)按分离胶配制表的比例（附后）取l号、2号试剂和蒸馏

2、水加入一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为分离胶溶液（此溶液约在半小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶，故应尽快操作。如室温较高时，为防止过快聚合，可放置冰浴中操作。或根据聚合速度的快慢，适当调整TEMED的加入量），(2)用5ml注射器、18号针头或用长细滴管吸取分离胶溶液，将其沿玻管管壁注入玻管，直至7cm划线平面。(3)用长细滴管吸取蒸馏水，沿管壁在分离胶的液面上加注0.5cm高的水层，加入时必须缓慢细流，尽量减少胶液表面的震动与混合。(加注水层是为了使凝胶聚合后的表面平整而不致出现弯月形，并能使凝胶与空气隔绝。这一步很重要，它将直接影响分辨率与带形)。(4)将加注好的凝胶管静置

3、1小时，以进行聚合反应。在聚合过程中，起初凝胶与水层的界面逐渐消失，待胶体形成后，其界面又将重新可辨。这现象可用来观察判断凝胶的聚合是否完成。3、浓缩胶的制备(1)按浓缩胶配制表的比例取2号、5号试剂和蒸馏水加入另一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为浓缩胶溶液。(在制备浓缩胶时，也常用核黄素催化的光聚合来代替过硫酸铵催化的化学聚合作用).(2)用滴管和滤纸小心地吸去已聚合好的分离胶胶面上的水液，注意切勿触及胶面。(3)用长细滴管或注射器吸取浓缩胶溶液，在分离胶胶面上沿玻管壁小心注入0.5lcm高的胶液。然后同样沿玻管壁缓慢细流地加入0.5cm高的蒸馏水，静置一小时后即可使用。

4、在加样之前先用滴管或滤纸小心地吸去浓缩胶胶面上的水液。(二）、加样用50l的微量注射器，取12 l 血清，加12l 的40蔗糖溶液(1:1稀释)，再加入40l 10.05溴酚兰指示剂，混匀。每管中加入该混合液16l，共可加4管，每管实际加入纯血清3l，含蛋白质196l(血清蛋白质含量为6.2克/100毫升血清)若需增减管数，亦照此加样比例推算。(三)、电泳1、将加样完毕的凝胶管上端垂直插入上电极槽底板的橡胶塞孔中并去掉下端的橡皮塞和胶布。2、先用长细滴管吸取电极缓冲液，在已插好的凝胶管样品液面上，小心地逐管加满电极缓冲液。然后将电极缓冲液慢慢地倒入上，下电极槽中。注意避免和排除凝胶管的上、下管

5、口内留有气泡，否则会影响导电。电极缓冲液的加入量，上槽以电极能完全浸入为宜，下槽以凝胶管浸入3/5为宜。3、将上槽的电极接电泳仪的负极，下槽的电极接电泳仪的正极。先调节电流为1mA/管；待示踪染料进入分离胶后，再调节电流为23mA/管。待示踪染料迁移至距管下0.5cm时，切断电源，电泳完毕。 (四)、剥胶取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸取蒸馏水作润滑针。将针头小心插入管壁与胶柱之间，一边注水，一边使针头紧贴管壁慢慢呈螺旋式前进。如果一头不行，再在另一头按同样的方法剥离，直至胶柱与管壁分开，从玻管中滑出。如胶柱不能滑出，可用洗耳球从一端加压吹出。 (五)、固定，染色及漂洗将剥出的胶柱浸入

6、9号试剂中泡30分钟，进行固定，染色，然后用清水冲洗掉多余的染料，放入10号试剂中漂洗脱色，在此过程中应经常更换漂洗液，直至背景几乎无色为止需时约23天。（如在60水浴中进行，时间可大为缩短)脱色后的胶柱放在7醋酸溶液中可长期保存。【试 剂】试剂号名称配制方法pH1分离胶缓冲IN HCI 48.0ml Tris 36.3g 加蒸馏水到100ml8.92单体交胶剂丙稀酰胺30.0g 甲叉双丙烯酰胺0.8g 加蒸馏水到100ml3催化剂10%过硫酸胺（临用前配制）100mg/ml4加速剂四甲基乙二胺（TEMED）1ml加蒸馏水 稀释到10ml5浓缩胶缓冲液IN HCI 48.0ml Tris 5.

7、98g 加蒸馏水到100ml6.76电极缓冲液甘氨酸28.8g Tris 6.0g 加蒸馏水至100ml临用前按1：10比例稀释8.37示踪染料溶液溴酚兰0.05g加蒸馏水溶解至100ml8固定液三氯醋酸12.50g加蒸馏水溶解至100ml9固定染色液氨基黑10B 0.5g 用7%醋酸液稀释到100ml10漂洗液冰醋酸7ml加蒸馏水至100ml凝胶溶液配制表试剂分离胶溶液（ml）浓缩胶溶液（ml）1号1.252号2.515号1.25蒸馏水6.057.353号0.050.14号0.15(1:10稀释液)0.3(1:10稀释液)总体积（ml）1010浓度（g/%）7.73.0附注：凝胶聚合速度受温度影响较大，温度低时，聚合速度减慢，需适当调整3号及4号试剂的用量，达到在30分钟左右聚合。【器材】1、园盘电泳槽。2、电泳仪3、玻管（10×0.6cm）4、50l微量注射器、5ml注射器。5、10cm长的局麻针头，10号针头6、长细滴管7、小浇杯8、橡皮管、吸耳球等【注意事项】1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。2、丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（4）保存。可