鱼腥草指纹图谱研究及其中黄酮类成分分离制备

1、 回流提取三次,合并提取液碱压浓缩得膏状物,将膏状物以1g:2mL的比例悬浮于水,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取.减压浓缩乙酸乙酯部分,得浸膏,备用。流程见图2.】。T 石油醚层1l坐星l-232硅腔柱层析2321样品的预处理图2-1浸膏分馏沆程图将2.31中得到的乙酸乙酯层浸膏用适量甲醇溶解,加入2倍量层析用硅胶拌匀.挥干溶剂.研磨粉碎。2322装柱装柱的具体步骤为:按样品与硅胶质量比1:20.计算出硅胶的质量,加入洗脱剂搅拌成匀浆,打开柱下面的活塞,将匀浆沿壁倒入层析柱,让柱中的溶剂军罕昱F 兰篙卤向下移动,沉降硅胶,待硅胶层上的溶剂高度降低至3-4cm时关闭活塞。液面上塞一层棉花,目的是防止

2、大量加入洗脱剂时把硅胶屡冲的不平整。2323柱层析分离将2321中的样品加到硅胶层析柱顶端,用氯仿/甲醇(v:V=I55:45作洗脱剂,每500mL接一瓶,用TLC点板,合并含相同组分的馏分。旋转蒸发除去溶剂,得浸膏,用甲醇溶解,供分析型HPLC检测和半制各HPLC分离。233分析HPLC色谱条件采用分析型HPLC法对合并后的样品试样进行分析.以便跟踪目标物质的位置以及对后续分离纯化所得的样品进行纯度检测,具体色谱条件如下:色谱柱:Acclaim R120CI s(250mmx46mml d,5gin;流动相A:0.05%磷酸溶液,流动相B:乙腈;梯度条件为015.2025.30-35.40.

3、60rain,2%一15%一155%一16%一18%一18%一20%.40%13:流速:1mLrain一:进样量:5uL:紫外检测波长:260n/ll柱温:30。234制备HPLC色谱条件采用制各型HPLC方法对经硅胶柱层析分离的样品进一步纯化,具体色谱条件如下:条件A,色谱杜:YMCPack ODSA(250mmxl0mm i d,5¨m:流动相:乙腈(溶剂A/005%磷酸(溶剂B-20:80;流速:3mL min"1:进样量:20HL:检测波长:260nm。条件B,流动相:乙腈(溶剂A/005%磷酸(溶剂B=15:85,其余同条件A。235定性LCMS条件将纯化的产品与

4、标准品进行对照,对比色谱峰的保留时间、紫外光谱图进行初步定性。并用LC.MS测定分子质量进一步验证色谱定性结果。色谱条件:流动相为甲醇/002%甲酸-40:60,其余同2.33。质谱条件:离子化方式为电喷雾离子化(ES r:正离子形式:扫描范围:50800 mzl:雾化气体流速:l5mLmin:接口温度:200。2.4结果与讨论24l黄酮类物质的粗提取提取工艺流程I”I:鱼腥草干草一90%乙醇提取3次_鱼腥草浸膏一加适量水得悬浮液_+加石油中南大学硕士学位论文第二章鱼腥草中黄酮类物质的分离和纯化醚(按悬浮液/石油醚-32,萃取3次_分层;取水相_+加乙酸乙酯(按悬浮液/乙酸乙酯=3:2,萃取3

5、次_分层;取乙酸乙酯相浓缩_÷浸膏90%乙醇提取的鱼腥草提取物中,组分复杂,包括强极性、中等极性、弱极性化合物,本实验的目的是提取分离其中的黄酮类化台物,属于中等极性的物质。本实验选择极性较小的石油醚和中等极性乙酸乙酯为萃取溶剂。首先用石油醚萃取,除去的是悬浮液中极性较小的物质,如脂类、色素等。乙酸乙酯是中等极性的溶剂,黄酮类化合物在其中有较好的溶解性,所以第二步使用乙酸乙酯萃取。由于黄酮类化台物集中在乙酸乙酯层,所毗将该层萃取液在40永浴条件下进行减压旋转蒸发,得到粘稠状浸膏.把浸膏转移到烧杯中,烧瓶内壁的浸膏用甲酵溶解下来,也转入烧杯中,将烧杯密封,放入冰箱内保存,以便硅胶柱层析

6、分离使用。2.42硅胶柱洗脱剂的优化采用硅胶柱层析对乙酸乙酯层浸膏进行分离纯化,首先通过TLC,寻找台适的展开剂作硅胶柱的洗脱荆。分别尝试了氧仿/甲醇、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙Of,/丙酮、氧仿/甲醇/乙酸等溶剂体系。石油醚/乙酸乙酯体系,由于两者都是极性较小的溶剂.所以用此体系作展开剂时,混合物的组分在板上移动很少,基本都处于薄层扳的下端,无法分开.效果图见图2.2a。乙酸乙酯/丙酮体系,组分相对集中且成点不好,效果图见图22b。氯仿/甲醇/乙酸体系极性较大,使混合物的组分都跑到薄层板上端.也无法达到分离效果,见图2.2c。氯仿,甲醇体系极性较为适中,但比例不同,分离效果也会有较大影响。氯仿

7、极性较小,甲醇极性较大,根据极性不同来调节体系中两种溶剂的比例以得到最佳结果。试验中尝试了18:2.17:3,16:4,146,15:5,165,】55 :55,155:45等比例。当氯仿/甲醇=15.5:45时,混合物中各组分在整个薄层板上分布较均匀,成点比较清晰。所以本实验选择氯仿/甲醇=155:45混合溶液作为洗脱剂。样品在用氯仿/甲醇-15545的溶液作为展开剂的薄层色谱图效果如图2.2d所示。图2-2薄层色谱图fa.石油醚/o酸L酯:b.L酸L酯/丙酮:c一氧仿/甲醇/o酸;d-氯仿/甲醇12.43硅胶柱的部分分离用优化好的洗脱剂将乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱洗脱,通过硅胶柱层析的洗脱分离,一共收集到179瓶(500lL/瓶,点板合并含相同组分的馏分,得到14瓶样品,结果见表2.3