引导文-培养基及其制备技术

1、子情境：引导文氨基酸基础知识培养基及其制备技术阅读材料材料一：微生物细胞的化学组成和营养要求（一）微生物细胞的化学组成 细胞化学成分 水（70%-90%） 干物质 有机物(蛋白质、多糖、脂、核酸占干重96% 维生素、有机酸及它们的降解物） 无机物（盐） 细胞含水量=（湿重-干重）/湿重×100% 细胞化学元素 主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫（占细胞干重97%）、 钾、镁、钙、铁； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等（二）微生物的营养要素及其生理功能微生物的6大营养要素：碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐和水一、碳源（carbon source） 在微生物生长过程

2、中提供碳素来源的物质1.功能 构成细胞成分（需要量最大的元素，占50%干重）； 形成代谢产物和储藏物； 异养型微生物的能源2. 碳源谱无机碳（CO2，NaHCO3，CaCO3）有机碳（糖、有机酸、醇、脂类等）（葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等）。3.根据碳源的不同筛选工业微生物菌种的方法。二、氮源（nitrogen source） 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质。1.功能 构成细胞中的蛋白质和核酸（需要量仅次于碳，12%）； 构成含氮代谢产物； 某些自养菌的能源（如硝化细菌：铵盐和硝酸盐兼氮源和能源）2. 氮源谱无机氮（硫酸铵（大肠杆菌，枯草芽孢杆菌）、硝酸钾（放线菌）、硝酸钠（

3、霉菌）、 氨、氮气） 有机氮（蛋白质及其降解产物（胨、肽、氨基酸等），尿素 常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、饼粉、蚕蛹粉、花生饼粉、玉米浆等 ） 硫酸铵：NH+4被细胞吸收后可直接利用速效氮源 NH+4被吸收后，导致pH下降生理酸性盐 硝酸盐：NO-3被细胞吸收后需进一步还原成NH+4后再被微生物利用迟效氮源 NO-3被吸收后，导致pH生高生理碱性盐 抗生素发酵：混合氮源 玉米浆：速效氮源（菌体生长） 黄豆饼粉，花生饼粉：迟效氮源（代谢产物） “氨基酸自养型”能以非氨基酸类的简单氮源（尿素、铵盐、硝酸盐和氮气）“氨基酸异养型”必须从外界吸收现成的氨基酸作氮源的微生物。3.根据氮源的不同筛选工

4、业微生物菌种的方法。三、 能源（energy source） 为微生物生命活动提供最初能量来源的物质或辐射能 能源谱： 化学物质：化能营养型 有机物：化能异养（能源=碳源） 无机物：化能自养（还原态无机物氧化提供能量） （还原态无机物：NH4+，NO-2，H2S，H2，Fe2+） 辐射能：光能营养型 四、生长因子（growth factor）1. 定义 微生物生长所必需且需要量很少，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足微生物生长需要的有机化合物。2. 谱（主要3大类） 维生素（狭义的生长因子） 氨基酸 嘌呤和嘧啶；五、 无机盐（inorganic salt） 常量元素：P、S、K、Mg、Na

5、等（10-310-4mol/L）； 微量元素：Zn、Mn、Mo、Ce、Co、Cu、Ni等（10-610-8mol/L） 提供方式 常量元素：K2HPO4，MgSO4（提供4种主要元素） 微量元素：自来水，玻璃器皿材料二：微生物的营养类型 根据碳源、能源的不同，分为四种基本营养类型： 光能自养型：以光为能源，以CO2或碳酸盐为唯一或主要碳源 光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养物 化能自养型：以无机物的氧化获得能量，以CO2或碳酸盐为唯一或主要碳源化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质材料三：营养物质进入细胞的方式 细胞质膜是控制营养物质进出细胞的主要屏障，具选择

6、通透性。1. 单纯扩散（simple diffusion） 营养物质通过细胞质膜上的小孔，由高浓度的胞外（内）环境向低浓度的胞内（外）进行扩散。单纯的物理扩散。 特点：无载体参与，不消耗细胞的能量，以浓差为动力，高浓向低浓扩散，物质在扩散过程中结构不变； 运送物质：水，O2, CO2，乙醇，甘油，脂肪酸等（分子量小、脂溶性、极性小的物质）2. 促进扩散（facilitated diffusion） 也是一种被动的物质跨膜运输方式，与扩散的主要区别在于需要借助载体的作用才能进入细胞。 特点：载体蛋白参与，不消耗细胞能量，以浓差为动力，由高浓向低浓运送，运输物质的分子结构不发生变化。 载体蛋白：具

7、较高的专一性；与运输物质的亲和力在质膜内外不同，通过载体分子构象变化实现；载体只影响物质的运输速率，并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态，扩散速度取决于溶质浓度梯度的大小，当运输物质浓度达到一定值时，载体产生饱和效应。这种性质类似于酶的作用特征，因此载体蛋白也称为透过酶（大都是诱导酶）。 运送物质：单糖，氨基酸，维生素、无机盐等；3.主动运输（active transport） 广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式特点：载体蛋白参与（具有较强的专一性，通过构象变化而改变与被运送物质之间的亲和力，载体蛋白构象变化需消耗能量），需消耗细胞能量，可逆浓差运输。运送物质：无机离子（K+等）；

8、糖（乳糖，麦芽糖，葡萄糖等）；大部分氨基酸和有机酸。 例：Na+,K+-ATPase：利用ATP的能量，将Na+由胞内泵出胞外（高浓），并将K+由泵入胞内（高浓）。4. 基团转位(group translocation) 特点：需载体蛋白，耗能，被运送物质分子结构发生变化（磷酸化） 有一个复杂的运输系统来完成物质的运输磷酸转移酶系统（PTS）：5种蛋白质组成功能：主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中，主要用于糖的运输。材料四：培养基（medium，media）定义：培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。一、选用和设计培养基的原则和方法 4个基本原则： 目的明确 营养协调

9、 物理、化学条件适宜 经济节约1. 目的明确（1）培养何种微生物 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基；（2）培养目的2. 营养协调 营养物的浓度 各种营养物间的配比（C/N比：培养基所含碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比）3. 物化条件适宜（1）pH 细菌：pH 7.08.0；放线菌：pH 7.58.5； 酵母菌：pH 3.86.0；霉菌：pH 4.05.8; （2）渗透压（osmotic presure）和水活度 水活度（water activity）：在天然环境中，微生物可实际利用的自由

10、水或游离水的含量。 w = Pw / Pow （Pw：溶液蒸汽压力； Pow：纯水蒸汽压力） 微生物一般在w为0.600.99的条件下生长，w过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适w不同。（3）氧化还原电位 增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加值（厌氧菌）； 在培养基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸(<0.05%)、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、庖肉等还原性物质可降低值（厌氧菌）。 氧化还原指示剂：刃天青4、经济节约二、培养基的种类1按对培养基成份的了解划分 天然培养基(complex m

11、edium) 合成培养基(synthetic medium) 半合成培养基(symi-synthetic medium)2根据物理状态划分 固体培养基(solid medium)（1.52.0%琼脂） 半固体培养基(semi-solid medium)（0.20.8%琼脂） 液体培养基(liquid medium)常用凝固剂： 琼脂：96 融化，40 凝固，1.52.0%； 明胶：25 融化，20 凝固，512%；3按用途划分（1）选择培养基(selective medium) 用途：用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。 定义：根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化

12、学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（2）鉴别培养基(differential medium) 用途：用于鉴别不同类型微生物的培养基。定义：在培养基中加有能与目的菌的无色代谢产物发生颜色反应的指示剂，从而用肉眼就能将该种微生物的菌落与外形相似的其它微生物菌落相区分的培养基。EMB培养基：肠道菌的鉴别性培养基 大肠杆菌：菌落紫黑色，铜绿色金属光泽 沙门氏菌等肠道致病菌：菌落无色原理：伊红和美蓝二种苯胺染料可抑制G+细菌和一些难培养的G细菌。在低酸度时，这二种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。试样中的多种肠道菌会在

13、EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨。例如大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体呈酸性，菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到铜绿色金属光泽。微生物与发酵工业的关系：1. 筛选菌种：根据碳源、氮源、生长因子来分离工业微生物菌种。2. 根据不同目的、不同菌种设计不同类型的培养基。回答问题：1. 试述微生物所需营养物的种类及功能（六大营养要素；生长因子的种类）。 2. 以能源和碳源来划分, 微生物的营养类型都有哪些? 3. 如何根据碳源、氮源的不同筛选工业微生物菌种？ 相关资料材料一：培养基的灭菌纯种培养的概念：在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许

14、其它微生物共存。如果杂菌一旦侵入生产系统，就会在短期内与生产菌争夺养料，严重影响生产菌正常生长和发酵作用，以至造成发酵异常。灭菌的方法、原理及影响因素一、灭菌的方法灭菌是指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。在整个发酵过程中，为了实现纯种培养，需要排除一切杂菌污染的可能，对培养基、消泡剂、补加的物料、空气系统、发酵设备、管道、阀门以及整个生产环境进行严格灭菌。灭菌的方法可分为物理法和化学法。物理法：加热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌）、过滤除菌、辐射灭菌等。化学法：利用无机或有机化学药剂进行灭菌。1.加热灭菌法：高温使菌体蛋白质变性或凝固，使酶失活而杀灭微生物的方法。（1）

15、干热灭菌法：灼烧灭菌法，利用火焰直接将微生物灼烧致死的方法干空气灭菌法，采用热空气使微生物细胞发生氧化、体内蛋白质变性（2）湿热灭菌法：利用饱和热蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。其原理是借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆变性，使微生物死亡。常用于大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。2.辐射灭菌法辐射灭菌是利用电磁波、紫外线、X射线、r-射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。3.过滤除菌法采用过滤的方法阻截微生物达到除菌目的。该法适用于澄清液体和气体的除菌，发酵工业上常用此方法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养使用。4.化学

16、药剂灭菌法化学药剂灭菌法是利用某些化学药剂渗透到微生物细胞内进行氧化、还原、水解等化学作用，引起细胞内蛋白质变性、酶类失活或细胞溶解而杀灭微生物的方法。常用的化学药剂有高锰酸钾、漂白粉、75%酒精溶液、新洁尔灭、甲醛、过氧乙酸等。要求明确并区分基本概念1灭菌与消毒的区别。2干热灭菌法与湿热灭菌法。3物理灭菌法与化学药剂灭菌法。5化学药剂灭菌法6间歇灭菌和连续灭菌材料二： 湿热灭菌的原理（一）概念1微生物的热阻：微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示。热阻是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。

17、各种不同的微生物，对热的抵抗能力不同，其热阻也不相同。表4-1 微生物对湿热的相对抵抗力微生物名称大肠杆菌细菌芽孢霉菌孢子病毒相对抵抗力13,000,000210152致死温度：杀死微生物的极限温度称为致死温度。3致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。（二）微生物的热死规律对数残留定律加热可使微生物死亡。微生物热死是指微生物受热失活直到死亡。微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固，丧失活力所致。在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞个数的变化如化学反应的浓度变化一样，遵循分子反应速度理论。在微生物受热失活的过程中，微生

18、物不断被杀死，活菌数不断被减少。因此，微生物热死速率可以用分子反应速度来表示，即微生物个数减少的速度与任一瞬间残存的菌数成正比。 （3-1）式中：N培养基中残留活菌数（个）；t受热时间（min）；k反应速度常数（min-1），也可称比死亡速率。反应速率常数k随微生物的种类和加热温度而变化。从0t，N0Nt，积分上式得： （3-2） （3-3） （3-4）式中：N0开始灭菌时原菌数 Nt经时间t后残留菌数式44即表示对数残留定律，可以根据残留菌数N的要求用上式计算灭菌时间t。将存活率对时间t在半对数坐标上绘图，可以得到一条直线，其斜率的绝对值为比死亡速率k。灭菌时间有时也采用1/10衰减时间t表

19、示。即活菌数在受热过程中减少到原菌数的1/10时所需的时间。从式（33）得： （3-5） （3-6）随时间的延长，加热灭菌后的残存菌数呈对数减少，且温度越高，死亡越快。对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留规律，特别是在受热后很短的时间内，培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高浓度盐类、色素能削减其耐热性。（三）灭菌时间确定的依据随着灭菌条件的加强，培养基成分的热变质加速，特别是维生素。因此培养液灭菌一般都采用高温短时间加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养成分的破坏减少到最低限度的目的。从式（4-4）可见，如果将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来考虑计算灭菌时间和温度，就得

20、延长加热时间和提高灭菌温度。 污染的程度（N0）一般 芽孢细菌之和为计算依据较为合理细菌的芽孢 另一个问题就是灭菌的程度，即残留菌数。如果要达到彻底灭菌，即Nt=0，则t为，这在实际操作中是不可能的。因此，在设计时常采用Nt=0.001（也就是说1000次灭菌中有一次失败的机会）。 反应速度常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。在相同的温度下，k值愈小，则此微生物愈耐热。细菌芽孢的k值比营养细胞小得多，即细菌芽孢耐热性比营养细胞大。同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌温度愈低，k值愈小；温度愈高，k值愈大。因此，提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间显著缩短。某些

21、细菌芽孢在121时的k值见表4-2。（四）培养基灭菌温度的选择在培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死外，还伴随着营养成分的破坏。实验证明，在高压加热情况下，氨基酸和维生素极易破坏，仅20分钟，就有50%的赖氨酸、精氨酸及其它碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能达到灭菌的目的，又能使培养基中营养成份破坏至最小的灭菌工艺条件。在培养基灭菌时，杂菌不断的死亡，杂菌死亡属于一级动力学类型，其速度常数K与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示： （4-7）式中：A比例常数；E杀死微生物所需的活化能； J/mol在灭菌的过程中，伴随微生物的死亡，培养基中的营养成分也遭到破

22、坏。由于大部分培养基的破坏为一级分解反应，其反应动力学方程式为： （4-8）式中：培养基中营养成分（反应物）的浓度，mol/L； t培养基中营养成分破坏的（反应时间），min； k（培养基中营养成分分解）化学反应速度常数，min-1（随温度及反应类型而变）在培养基灭菌的过程中，其他条件不变，则营养成分破坏的速度常数和温度的关系亦可用阿累尼乌斯方程表示： （4-9）式中：比例常数；E营养成分破坏所需的活化能,，J/mol；R气体常数；8.314 J/mol·k；T绝对温度， K；在灭菌时，温度由T1升高到T2，杂菌死亡的速率常数： （4-10） （4-11）两式相除得： （4-12）同

23、理，当温度温度由T1升高到T2，培养基成份的破坏的速率常数为，也可得类似的关系： （4-13）将式（4-12）和式（4-13）相除得： （4-14）通过实际测定，一般杀灭微生物营养细胞的E值约为2.09´1052.71´105 J/mol，杀死微生物芽孢的E值约为4.48´105 J/mol ，一般酶及维生素等营养成分分解的值为8.36´1038.36´104 J/mol。微生物细胞死亡的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E，因此，即随着温度升高，灭菌速度常数增加的倍数大于培养基中营养成分分解的速度常数的增加倍数。当灭菌温度升高时，微生物死

24、亡速度提高，且超过了培养基营养成分破坏的速度。据测定，每升高10速度常数的增加倍数为Q10，一般的化学反应Q10为1.52.0，杀灭芽孢的反应Q10为5-10，杀灭微生物细胞的反应Q10为35左右。在加热灭菌的过程中，发生两个过程：微生物死亡培养基成分破坏温度均能加速其过程进行的速度，当温度升高时，微生物死亡的速度更快。因此，可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。灭菌温度较高而时间较短，要比温度较低而时间较长效果好。比较灭菌条件：Q：126132，5-7分钟连续灭菌和120，30分钟的实罐灭菌，哪一个对培养基质量影响小？同样达到灭菌

25、的要求。不同灭菌条件下培养基营养成分的破坏亦不同见表4-3。P84材料三：影响培养基灭菌的因素灭菌是一个非常复杂的过程，它包括热量传递和微生物细胞内的一系列生化、生理变化过程，并受到多种因素的影响。1.温度的影响2.灭菌物中pH的影响培养液中pH对微生物的耐热性影响很大。一般来说，多数微生物在pH接近中性时，其耐热性较强；当pH偏酸性时，氢离子较易渗入微生物细胞内，促使微生物细胞死亡，故pH越低时，灭菌所需要的时间就越短。见表3-4.3.灭菌时间的影响灭菌作用需要维持一定时间才能达到灭菌目的。例子：无芽孢细菌温度在55-65度作用30min才能死亡，酵母菌和曲霉菌的营养细胞在60-80度作用1

26、0min才能致死。一般说来，作用时间越长，灭菌效果越好。4.培养基成分的影响培养基中脂肪、糖分和蛋白质等含量较高，微生物的热死亡速率就越慢，这是因为脂肪、糖分和蛋白质等有机物在微生物细胞外面形成一层薄膜，能够有效保护微生物细胞抵抗不良环境，所以灭菌温度相应要高些。例如：大肠杆菌培养基中高浓度的盐类、色素等的存在，会削弱微生物细胞的耐热性，故较易灭菌。5.培养基中微生物的影响越多，需要时间越长。6.培养基中水分含量的影响水分含量少，干物质多，灭菌热穿透力不强，对浓度低的培养基进行灭菌比对浓度高的培养基进行灭菌容易彻底7.培养基中颗粒的影响颗粒大，灭菌容易；颗粒小，灭菌困难。颗粒多，灭菌温度提高。

27、8.泡沫的影响泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使热量传递困难，热量难以穿透空气层，泡沫内部不易达到微生物的致死温度，容易导致灭菌不彻底。对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入适量消泡剂防止泡沫产生。材料四： 培养基灭菌时间计算（1）分批灭菌（实罐灭菌）灭菌升温阶段所保温阶段（灭菌温度） 均有灭菌效应降温阶段培养基灭菌温度不断升高，菌死亡速度常数也不断增大。当培养基加热至100以上，灭菌作用较为显著，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间较短，在计算时一般不考虑。因此，保温灭菌时间实际上比计算的时间要短。仅考虑保温阶段的灭菌效果，可粗略地求得灭菌所需的时间。EG 有一发酵罐内装40m

28、3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。培养基含有芽孢细菌2×105个/mL，其他细菌4.2×104个/mL，121时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。解 N0=40×106×2×105=8×1012（个） Nt=0.001（个），k=1.8（min-1）灭菌时间：当以某耐热杆菌的芽孢为灭菌对象时，此时A=1.34×1036S-1，E=2.84´104J/mol，R=8.314 J/mol，因此，式可写为：即： （4-15）利用式4-15可求得不同温度下的灭菌速度常数。若欲

29、求得升温阶段（如温度从T1升至T2）的平均杂菌死亡速度常数，可以用下式求得： （4-17）式中4-17中的积分值可利用图解积分法求得。若培养基加热时间（一般以100至保温的升温时间）p已知，km已求得，则升温阶段结束时，培养基中残留菌数（NP）可从下式求得 （4-18）再由下式求得保温所需的时间 （4-19）（2）连续灭菌连续灭菌的灭菌时间，仍可用式计算，但培养基中的含菌数，应改为每1mL培养基的含菌数，则式4-4变换为下式： （4-20）式中：c0及cs分别为单位体积培养基灭菌前和灭菌后的含菌数，（个/mL）。4分批灭菌和连续灭菌比较（自行列表进行比较）材料五：培养基与设备、管道灭菌条件1杀

30、菌锅内灭菌 固体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持2030min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持1520min；玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098MPa 3060min。2种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过达到死角灭菌，灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0.098MPa。3空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174MPa灭菌2h。灭菌完毕

31、，通入压缩空气吹干。4种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121，维持30min。谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110，维持10min。5发酵培养基实罐实菌 从夹层或盘管进入蒸汽，间接加热至90，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121，维持30min。谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为105，维持5min。6发酵培养基连续灭菌 一般培养基为130，维持5min，谷氨酸发酵培养基为11568min。7消泡剂灭菌 直接加热至121，维持30min。8补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉

32、料液为121，维持5min。9尿素溶液灭菌 105，维持5min。让我们回答问题吧！1.培养基为什么需要灭菌？ 2.培养基灭菌的注意事项： 技能训练一：玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌一、实训目的 1.了解微生物项目中玻璃器皿洗涤的重要性。 2.掌握玻璃器皿的洗涤方法。 3.熟悉玻璃器皿灭菌的原理及方法。二、实训原理 微生物项目是纯种培养，必须是无菌的。因而微生物项目需要的所有的玻璃器皿，无论是新购置的还是使用过的，都必须经过仔细地清洗和严格的灭菌后才能使用。三、实训器材 试管（大试管和小试管）、小塑料管（发酵小倒管或德汉小管）、各种规格的玻璃吸管、培养皿（平皿）、锥形瓶及烧杯、载玻片与盖玻片、滴瓶

33、、玻璃涂布棒等、装培养皿的金属筒、干热灭菌箱等。四、实训方法与步骤 1.玻璃器皿的洗涤 （1）新购置的玻璃器皿的洗涤 新购置的玻璃器皿一般含较多的游离的碱，可在2的盐酸或洗涤液内先浸泡几小时后，用自来水冲洗干净，倒置在洗涤架上，晾干或在干燥箱内烘干备用。 （2）使用过的玻璃器皿的洗涤 (a) 试管、培养皿、锥形瓶、烧杯的洗涤 可先用瓶刷（或试管刷）沾洗衣粉或去污粉等刷洗，然后用自来水冲洗干净。洗涤后，要求内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净。如还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗干净。培养皿放入装培养皿的金属筒内，或用牛皮纸包扎好备用。 (b) 玻璃吸管的洗涤 吸过菌液

34、的吸管（如有棉塞应先去掉）或滴管（先拔去橡皮头）应立即放入2的煤酚皂溶液或0.5新洁尔灭消毒液内浸泡数小时，然后再用自来水冲洗干净，必要时还需用蒸馏水淋洗。最后放入烘箱内烘干备用。 (c) 载玻片和盖玻片的洗涤 如玻片上有香柏油，先用二甲苯溶解油垢，再在肥皂水中煮沸l0min左右，用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡12h，用自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水淋洗。等干燥后置于95乙醇中保存备用。 2.玻璃器皿的包扎 培养皿用牛皮纸包裹，或直接放入特制的金属筒内（图9-4），进行干热灭菌。干燥的吸管上端塞入11.5cm的棉花，再用纸条以螺旋式包扎。包好的多支吸管用牛皮纸包成捆灭菌（图9-5）。试管、

35、锥形瓶塞上棉塞后用牛皮纸包扎好灭菌。l 2图3-1 装培养皿的金属筒1-内部框架；2-带盖外筒图3-2 单支吸管的包扎方法18表示包扎先后顺序3.玻璃器皿灭菌用干燥的热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌的物品放在鼓风箱内，在160170加热12h。干热灭菌箱的构造如图9-6。图3-3 干热灭菌箱1-温度计与排气孔；2-温度调节旋钮；3-指示灯；4-温度调节器；5-鼓风钮4.干热灭菌的操作步骤 (a)装箱 将包扎好的玻璃器皿放入干热灭菌箱灭菌专用的铁盒内，关好箱门。 (b)灭菌 接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，待温度升至80100时关闭排气孔。继续升温至160170，开始计时，恒温12

36、h。 (c)灭菌结束 关闭电源，自然降温至60，打开箱门，取出物品放置备用。注意：灭菌物品不能有水，否则干热灭菌中易爆裂；灭菌物品不能装得太挤，以免影响温度上升；灭菌温度不能超过180，否则棉塞及牛皮纸会烧焦，甚至燃烧；自然降温至60以下，才能打开箱门，取出物品，以免因突然降温导致玻璃器皿炸裂。五、实训报告根据实训过程记录重点流程，并进行相应分析。技能训练二：培养基的制备一、 实训目的了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法和步骤。二、 实训原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源

37、、氮源、能源、无机盐、生长因子等，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。另外，不同的微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对一般细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯培养基（PDA），有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有

38、霉菌所需的各种营养物质外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉菌可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。 此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，己配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度所带来不利的影响。三、 实训器材1. 试剂牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol.L-1 NaOH, l mol.L-1HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O2. 设备与

39、仪器试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶竹、止水夹、天平、高压蒸汽灭菌锅等。四、 实训方法与步骤1. 牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl 5g, 琼脂1520g，水1000mL, pH7.47. 6(1) 称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。 *蛋白胨极易吸潮

40、，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也小要盖错。(2) 加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，可将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.52.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热融化同步进行，节省时间。*在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。(3) 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加l m

41、ol.L-1 NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用l mol.L-1HCl进行调节。对于有些要求pH较精密的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。 *应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。(4) 过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。(5) 分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图3-4）。*分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

42、半固体培养基（指液体培养基中添加0.6-0.8%的琼脂）以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。(6) 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。(7) 包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组

43、别、日期。(8) 灭菌将上述培养基于121湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，需保存在冰箱中。(9) 摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2（图3-5）。(10) 无菌检查将灭菌的培养基放入37温箱中培养2448h,无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。图3-4培养基的分装图3-5 斜面的放置五、报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。技能训练三：高氏号培养基的配制一、实训目的了解高氏I号培养基的配制原理，并掌握其配制方法和步骤。二、实训原理高氏号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。三、