MTT法检测胃癌患者肿瘤细胞对化疗药物敏感度的研究

1、1Jaeschke W,Tow nshend A.The study about chem ilum inescencephenom enon of inorganic oxidantJ.A t m os Env iron,1978,12(5:7152718.2I oanna IK,Evangel os GS,A ntony CC.Determ inati on ofmorphine by fl ow injecti on analysis w ith che m ilum inescencedetecti onJ.A naly st,1988,113(4:6032605.3李正华.药物化学M

2、.3版.北京:人民卫生出版社,1993:288.4何云华,吕九如.高锰酸钾2甲醛2无机还原剂化学发光体系J.分析化学,2002,30(5:5982601.5N ie F,H e YH,L u JR.A n investigati on of theche m ilum inescence reacti on in the s odium sych l o rite2fo lic acid2e m icarbazide hydroch l o ride syste mJ.M icroche m ical J ou rna,2000,65(3:3392342.6祝兴华,何云华,刘梅,等.锰( 2抗

3、坏血酸2甲醛化学发光体系的研究J.分析化学,2004,32(6:7522754.7张红鸽,祝新华,何云华.锰( 2安乃近2甲醛化学发光体系的研究J.分析试验室,2005,24(1:527.8叶蕾,张国芳,陈洪渊.化学发光新体系N a I O42H2O22痕量环己烷2多羟基酚的研究及其应用J.高等学校化学学报,2000,20(1:59261.9Khan AV,Kasha M.Studies of the che m ilum inesce2nce reacti on reas on of po lyhydropheno lsJ.N atu re(L ond on,1964,204:2412243

4、.10Khan AV,Kasha M J.T he che m ilum inescencephenom enon of s odium peri odateJ.A m Che mS oc,1966,88(7:157421577.收稿日期:2008207215修回日期:2008208214M T T法检测胃癌患者肿瘤细胞对化疗药物敏感度的研究李胜水,李双标,张风梅,刘岩,许华(河北省沧州中西医结合医院病理科,河北沧州061001摘要:目的探讨32(4,5222噻唑2(2,52二苯基溴化四氮唑蓝(M T T药敏试验法在指导临床胃癌化疗中的作用。方法应用M T T法检测40例胃癌新鲜标本肿瘤细胞对

5、20种化疗药物的敏感度。结果对胃癌细胞抑制率强的药物为PTX, ADM,BCNU,e ADM,A ra2C;对胃癌细胞抑制率较弱的化疗药物为CTX,O PT,V P216,I CTX,PY M。结论M T T药物敏感试验对于提高胃癌化疗效果,减少用药盲目性具有重要意义。关键词:肿瘤细胞;M T T法;药物敏感试验中图分类号:R73512;R730153文献标志码:A文章编号:167127414(2008062043202胃癌化学药物治疗是当前对肿瘤病人治疗的重要手段之一,由于肿瘤细胞的异质性,凭医生经验所选用的化疗药物特异性差,况且因为个体差异等诸多因素,同一肿瘤不同个体,甚至同一个体疾病发展

6、的不同阶段其化疗效果也不尽一致。为此,以指导肿瘤化疗个体化,减少化疗用药的盲目性为目的的化疗药物敏感试验,日益受到临床医生的重视,并作为肿瘤化疗用药的参考依据1。本研究应用M T T法,检测40例胃癌新鲜标本肿瘤细胞对20种化疗药物的敏感度,结果表明,该方法具有良好的应用前景和临床指导意义。1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源:2004年11月2006年8月胃癌根治标本40例,来自沧州中西医结合医院17例,沧州市人民医院5例,沧州市和平医院4例,青县医院4例,泊头市医院3例,黄骅市医院3例,东光县中医院2例,沧州市中心医院2例。男性29例,女性11例,年龄2672岁,平均年龄54.3岁。1

7、.1.2仪器设备:M CD215A C型二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司产品,DNM29600型酶标分析仪(北京普朗公司产品,XD S21B型倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品,BFX52320型医用低速离心机(浙江省白洋离心机厂产品,生物安全 级实验室及 级生物安全柜(河北省长风净化设备厂产品。1.1.3主要试剂:含20种化疗药物的微孔检测板(A,B两块各含10种化疗药物;DM E M完全培养液;M T T试剂,二甲基亚砜(DM SO。“肿瘤化疗药物敏感度检测”M T T法试剂为泰伦生物科技(石家庄有限公司产品,批号:041025。1.1.4抗癌药物:A板10种:卡氮芥(BCNU,紫杉醇(PT

8、X,阿霉素(ADM,长春瑞滨(NVB,表阿霉素(e ADM,米托蒽醌(M IT,阿糖胞苷(A ra2 C,顺铂(CDD P,环磷酰胺(CTX,52氟尿嘧啶(52 FU;B板10种:长春新碱(V CR,足叶乙甙(V P2 16,甲氨喋呤(M TX,卡铂(CBDCA,平阳霉素(PY M,氮烯咪胺(D T I C,羟基喜树碱(O PT,异环磷酰胺(I CTX,草酸铂(L2OH P,双氟胞苷(GE M。1.2方法1.2.1肿瘤单细胞悬液的制备:无菌条件下切取肿瘤组织,于1h内送检,直径约1c m大小,无坏死及过多平滑肌组织,在生物安全 级实验室的 级生物安全柜内,用PBS液反复洗涤后去除肿瘤边作者简介

9、:李胜水(1963-,男,河北沧州人,主任医师,研究方向:肿瘤病理,Tel:138*,0317*,E2m ail:bssli。缘的纤维及脂肪组织,眼科剪反复剪切成糊状,用200目不锈钢筛网过滤,以GKN液洗涤两次后加入DM E M完全培养液,配制成2105 m l的单细胞悬液。1.2.2肿瘤细胞培养:将A,B预制检测板从冰箱中取出,平衡至室温。将肿瘤细胞悬液均匀加入检测板微孔中(每孔200l,每种药物设两个复孔,另设空白对照与调零孔,将检测板置于37,5 m l dl CO2培养箱内培养48h后,每孔加入M T T 试剂20l,轻轻混匀,继续培养612h,取出检测板以1000r m in离心1

10、5m in,每孔加入DM SO100l,充分震荡直至微孔内的紫色结晶全部溶解,用酶标分析仪在570nm读取各孔吸光度(A值,按以下公式计算相对抑制率(I R:相对抑制率(I R=1-(给药孔平均A值 对照孔平均A值100%1.2.3检测结果判定与分析:根据计算出的I R值按以下标准判断每种药物的敏感度:I R50%:高度敏感;30%I R50%:敏感;I R30%:不敏感,采用均数标准差(xs进行结果分析。2结果PTX,ADM,BCNU,e ADM,A ra2C对胃癌肿瘤细胞的抑制作用较强,敏感度为85.092. 5%;CTX,O PT,V P216,I CTX,PY M对胃癌肿瘤细胞的抑制作

11、用较弱,敏感度为5.025.0%,见表1。表120种化疗药物对40例胃癌肿瘤细胞药敏检测结果化疗药物I R值(%,xs高敏感敏感不敏感敏感率(%PTX ADM BCNU eADM A ra2C 52FU M TX CDDP VCR NVB M IT GE M L2OHP CBDCA DT I C PY M I CTX V P216 OPT CTX 51.2014.2649.4213.4248.3114.1448.1313.2147.5615.5347.1413.3743.1614.2741.5512.6439.2113.4632.1712.1831.0711.4426.6914.2124.20

12、13.1723.1811.4721.6412.2116.2111.2115.7711.3713.2110.4110.118.749.456.37242221212019121010975313151514141218211917181512141210866233456910911141520252628303234343892.592.590.08715851077157510771572156510621550103715351030.025.020.015.015.05.03讨论M T T比色法的基本原理是通过肿瘤细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶,能把32(4,52 22噻唑2(2,52

13、二苯基溴化四氮唑蓝(M T T还原成蓝色的甲月赞(fo r m azan,其还原量的多少与药物作用后的细胞活性呈正相关,这是1963年由Slater 等2发现的。1983年M o s m a m nn3报道了M T T比色法分析计算细胞对各种药物的抑制率。20世纪90年代以来,M T T法以其简便、快速、准确、重复性好并可同时进行多种化疗药物的药敏检测等优点,已应用到肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、淋巴瘤、骨肉瘤、胶质瘤等恶性肿瘤,并且收到较好的疗效47。本研究同时对11例胃癌患者外周血淋巴细胞进行药物敏感试验,结果与肿瘤细胞试验呈正相关,但淋巴细胞抑制率略低于肿瘤细胞。分子

14、生物学技术已证实,机体对药物的敏感度与遗传有关(如先天耐药和M DR多药耐药,肿瘤细胞同样具有耐药基因的表达。本研究通过肿瘤细胞抑制率的高低而预测胃癌肿瘤细胞的药物敏感度,以辅助解决肿瘤病人的个体化疗用药问题,从而提高肿瘤治疗效果,减少毒副作用,避免无效化疗。鉴于本研究为体外试验,培养基中生长的细胞并不能完全代表组成体内肿瘤的恶性细胞,故对药物的敏感度与体内试验结果可能不完全一致。另外,细胞浓度的高低,药物浓度,加药及药物作用的时间,细胞分散、加样、吸液等引起的M T T法等误差,某些非直接作用及有色药物等均可影响试验结果准确性。随着实验方法的不断完善及M T T法在肿瘤化疗药物敏感度试验中的

15、科学性和可行性,对于实现肿瘤病人个体化治疗具有重要意义,值得进一步推广。参考文献:1王艳萍,陈晓禾,周清华,等.肺癌患者外周血淋巴细胞与癌细胞体外化疗药敏实验研究J.中国肺癌杂志,2004,7(6:4802482.2Slater T F,Saw yer B,StrauliU.Studies on succina2te2tetrazo lium saltsJ.B ioche m B iop hy s A cta,1963,77:383.3M om ann T.R ap id co l o ri m etric assay fo r cellular gr2ow th and survival:app licati on to p ro liferati on andcyto tox icity assaysJ.J Imm unol M eth,1983,65:55.4韩晓凤,王艳婷,欧阳仁荣.M T T法体外药敏试验研究进展J.肿瘤,1999,19(1:55258.5徐建明,宋三泰,汤仲明,等.M T T法体外药敏试