喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖鼻腔给药微球的研究

1、喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖鼻腔给药微球的研究蔡鑫君，夏爱晓，柴国宝，魏颖慧，冯健，李范珠基金项目：国家自然科学基金资助项目（30371781），国家自然科学基金资助项目(30772793)，第一作者简介：蔡鑫君（1985-），男，硕士研究生，主要研究方向为中药新剂型。Tel:(0571)86613726 E-mail:zjtcmcxj *通讯作者：李范珠，男，教授，博士生导师 研究方向：药物新技术与新剂型研究。Tel:(0571)86633030 E-mail:Lifanzhu(浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053)摘要： 目的 制备神经毒素壳聚糖微球，并对其体外释药模式进行研究。方

2、法 采用喷雾干燥法制备神经毒素壳聚糖微球，以包封产率为指标，考察了处方与工艺因素对壳聚糖微球的影响，并采用正交设计L9(3)4对处方和工艺进行了优化。结果 最优处方为壳聚糖浓度为0.75，壳聚糖-TPP重量比为101，进口温度105，空气流速550L/h。优化处方制备的神经毒素壳聚糖微球表面圆整，载药量为(19.23±0.42)，包封产率为(92.10±2.1)，平均粒径为(6.86±0.76)m。体外释药数据用Higuchi模型拟合得方程Q=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，表明该微球具有缓释作用。结论 采用喷雾干燥法制备微球，具有工艺稳定、可连

3、续操作等优点，制备的神经毒素壳聚糖微球具有较好的缓释特性，关键词：喷雾干燥法；神经毒素；壳聚糖微球；体外释放Preparation of Chitosan Microspheres Loaded with Neurotoxin-for Nasal Delivery by Spray Drying TechniqueCAI Xin-jun, XIA Ai-xiao, CHAI Guo-bao,WEI Ying-hui, Fen Jian,LI Fan-zhu*(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical Universi

4、ty, Hangzhou 310053)ABSTRACT: OBJECTIVE To prepare the preparation of neurotoxin-loaded chitosan microspheres and to investigate the drug release behavior in vitro. Methods Microspheres were prepared using the spray drying method，the encapsulation efficiency was used to evaluate the influence of dif

5、ferent formulation and preparation factors，the formulation was optimized by orthogonal design L9(3)4. Results The optimal formulation was as follows：chitosan concentration (0.75%)，ratio of chitosan to TPP (10：1)，inlet temperature (105)，air flow rate (550L/h).The optimized microspheres had a spherica

6、l shape，the drug loading was (19.23±0.42)%，encapsulation efficiency was(92.10±2.1)%，average diameter was(6.86±0.76) m.The drug release profile in vitro could be described by Higuchi equation Q=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，the results showed the microspheres prepared obviously sustained re

7、lease effect. Conclusion Preparation of sustained-release microcapsule by spray drying is a simple method，the process is stable.Key Word: spray drying technique; neurotoxin-; chitosan microspheres; in vitro release 神经毒素(neurotoxin-，NT-)是从云南眼镜蛇毒液中分离得到的一类短链神经毒素的主要成分之一，具有中枢镇痛作用，无耐受性和依赖性，安全性高，主要以肌注方式用于控

8、制各种疼痛及戒毒，起效较慢(约35h)，难以满足临床需求1。鼻腔给药是目前研究较多的适合多肽蛋白质类药物的新型给药系统，药物吸收迅速，可避免肝首过作用、消化道黏膜的代谢和降解，给药方便，患者依从性好。研究表明，鼻腔给药对相对分子质量(Mr)小于1000的脂溶性药物吸收较好2,3。由于NT-的Mr较大(6700)，易溶于水，直接鼻腔给药吸收有限4。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物黏附性，同时能促进蛋白质等大分子药物透过黏膜，因此在鼻腔微粒给药系统中的应用日益增多5。喷雾干燥法制备微球具有一次成球、干燥时间短、易实现扩大生产等优点，尤其适于蛋白质等热敏性药物的微囊化6。为提高NT-鼻腔给药的生物利

9、用度，本研究以生物降解型高分子材料壳聚糖为载体，以三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，TPP)为交联剂，采用喷雾干燥法制备NT-微球，用正交设计优化处方，并考察其体外释放行为。1 仪器与试药290型喷雾干燥机(瑞士Büchi公司)；UV-1700型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；XL30 ESEM型扫描电子显微镜(Phlips公司)；Winner 2000Z型智能全自动台式激光粒度分析仪(济南微纳仪器有限公司)。NT-原药(中国科学院昆明动物研究所，纯度99，批号060530)；壳聚糖(上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度85，黏度0.1Pa·s，批

10、号050106)；试剂自制，4NaCO3溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液的等体积混合液和1CuSO4溶液与2酒石酸钾钠溶液的等体积混合液按501(v/v)混匀，临用前配制；Folin试剂(上海喜润化学工业有限公司)；透析袋(截留分子量为15000，上海绿鸟科技发展有限公司)；其它试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 NT-壳聚糖微球的制备7用喷雾干燥法制备NT-壳聚糖微球。精密称取壳聚糖适量，用1乙酸溶解后配成不同浓度备用。NT-与壳聚糖按41(w/w)混合，搅匀，再按不同重量比将1 TPP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液，1000r/min搅拌固化30min，静置待无气泡时即可，分别在不同进口温度、

11、不同空气流速下进行喷雾干燥得到微球粉末。同法制备不含NT-的空白微球。2.2 微球载药量和包封产率的测定2.2.1 分析方法取空白微球100mg和NT-水溶液(103.2mg/ml l)适量，置同一烧杯中，精密加入3柠檬酸钠溶液50ml，室温下搅拌(300r/min)24h使微球溶解，离心(10625×g)10min，取上清液1ml，用蒸馏水定容至5ml，用Lowry法8,9在650nm处测定吸光度(D)。另取未加入NT-溶液的空白微球100mg同法操作。结果表明，空白微球在650nm处无吸收，对NT-含量的检测无干扰。2.2.2 标准曲线精密称取NT-适量，加水溶解并稀释成2.58

12、mg/ml的贮备液。精密吸取贮备液适量，用水稀释成浓度为25.8、51.6、103.2、154.8、206.4、258mg/ml标准溶液。分别精密吸取1ml，各置试管中，加入试剂 5ml，涡旋混匀，于30保温10min，再加入Folin试剂0.5ml，涡旋混匀后继续保温30min。另取蒸馏水2ml，试剂和Folin试剂的用量为10ml和1ml，其它操作同上，作为空白对照，于650nm处测定D。以D对NT-浓度(c)线性回归，得标准曲线方程D=0.0022c+0.0102，r=0.9995，表明NT-在浓度为25.8258g/ml内线性关系良好。2.2.3 精密度试验分别精密量取250、125、

13、62.5mg/ml的NT-溶液，各5份，按“2.2.2”项下方法测定，计算得高、中、低浓度的日内RSD分别为0.29、0.25、0.94；连续5d测定，计算得日间RSD分别为0.45、0.62、0.86。2.2.4 回收率试验精密称取空白微球100mg，分别加入250、125、 62.5mg/ml的NT-溶液，各5份，按“2.2.2”项下方法测定，计算得高、中、低浓度的方法平均回收率分别为98.5、100.1、99.0，RSD分别为1.02、1.87、1.25。2.2.5 载药量和包封产率的测定精密称取含药微球约100mg，置锥形瓶中，按“2.2.2”项下方法操作测定，由标准曲线计算NT-含量

14、，计算载药量与包封产率(包封产率=微球实际载药量/微球理论载药量×100)10,11。2.3 正交设计优化处方和工艺在预试验基础上采用正交设计考察影响微球包封产率的4个因素：壳聚糖浓度(A)、壳聚糖与TPP的重量比(B)、进口温度(C)、空气流速(D)，各取3水平(见表1)。按L9(34)表安排试验，以包封产率为考察指标，优选最佳处方工艺，重复实验3次，考察微球制备工艺的重现性。正交实验因素水平表见表1。表1 因素和水平Table 1 Factors and levels水平因素A /w·v-1B /w·w-1C /D /L·h-110.2510：110

15、045020.5015：110550030.7520：1110550表2 正交试验结果Table 2 Calculation and analysis of orthogonal testNOABCD包封产率%1111181.352122280.453133379.054212388.075223180.856231285.357313287.108321387.409332187.15均值80.28385.50784.70083.117均值84.75782.90085.22384.300均值87.21783.85082.33384.840极差6.9342.6072.8901.723结果表明，

16、各因素对包封产率的影响依次为ACBD，最佳组合为A3B1C2D3，即壳聚糖浓度为0.75，壳聚糖-TPP重量比为101，进口温度105，空气流速550L/h。2.4 优化处方工艺验证按优化处方制备3批NT-壳聚糖微球，载药量和包封产率为(19.23±0.42)、(92.10±2.1)，表明处方工艺重现性较好。2.4.1 微球的形态及粒径分布取适量微球用扫描电镜观察，结果表明微球外形圆整，大小均匀(图1)。将制得的NT-壳聚糖微球混悬于无水乙醇中，用激光粒度仪测得微球粒径平均粒径为(6.86±0.76) mm(n=3)。 图1 NT-微球的扫描电镜照片(A：

17、5;1000，B：×4000)Fig.1 Pattern of NT- microspheres by SEM(A：×1000，B：×4000)2.4.2 体外释放实验采用恒温振荡法。精密称取NT-或NT-壳聚糖微球适量，装入透析袋内，扎紧后置磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，(37±0.5)振荡(速率100r/min)。分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、48、72、96h取样1ml(同时补加等量同温介质)，用Lowry法测定样品中NT-含量，计算累积释放率(Q)，结果见图2。NT-原药；NT-壳聚糖微球图2 体外释放曲

18、线(n=3)NT-；NT-chitosan microspheresFig.2 Drug releasing curve of NT-from microspheres（n3）结果表明，NT-粉末4h内释放完全；NT-壳聚糖微球12h累积释放率38.8，96h基本释放完全。经Higuchi模型拟合得方程Q=11.42t1/2-5.89，r=0.9920，说明NT-壳聚糖微球有缓释作用。3 讨论3.1 曾考察了不同脱乙酰度的壳聚糖对微球形成的影响。结果表明，当壳聚糖脱乙酰度大于90时，与TPP溶液混合后易形成絮状沉淀；当脱乙酰度低于90时，与TPP交联固化后的溶液仍保持澄清。这可能是由于脱乙酰度

19、高的壳聚糖有更多带正电的氨基，与带负电荷的TPP发生过度交联后易形成沉淀。3.2 由于NT-是多肽类药物，制备过程中会受到温度等外界因素对多肽结构和生物活性的影响。我们采用小鼠热板法考察温度对神经毒素镇痛活性的影响，结果发现神经毒素在40、60、80、100等不同温度处理后的镇痛抑制率分别为54.4%、44.3%、43.7%、42.9%，镇痛活性并没有显著差异，说明神经毒素是一种热稳定性较高的多肽药物。因此，当喷雾干燥仪的出口温度低于100时，对药物的活性影响较小，而出口温度同时受进料速度、进口温度、空气流速、物料性质等影响，故试验设计时未把出口温度作为因素考察，重点考察进口温度、空气流速等工

20、艺因素对微球包封产率的影响。而且优化后的出口温度保持在7274，对NT-的活性影响不大。3.3 体外释放试验表明，NT-壳聚糖微球在前12h内的累积释放38.8。这是由于微球表面吸附有药物的微小结晶(图1)，因此当微球接触释放介质后，微球表面的NT-迅速释放，形成突释。随后的释放相对缓慢，这是由于TPP与壳聚糖上的氨基形成离子交联，促进微球表面固化，释放介质渗入缓慢，延缓了药物的释放。这样可保证药物在较长一段时间内维持有效血药浓度，产生缓释效应。REFERENCES 1 Lu QM, Meng QX, Li DS, et al. Comparative study of three short

21、-chain neurotoxins from the venom of Naja kaouthia (Yunnan, China) J. J Nat Toxins, 2002, 11(3): 221-229. 2 Uqwoke MI, Aqu RU, Verbeke N, et al. Nasal mucoadhesive drug delivery: background, applications, trends and future perspectives J. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57(11): 1640-1665.3 FENG J,LI F Z.A

22、dvances on transnasal absorption enhancement of pepide and protein drugsJ. China Pharm J(中国药学杂志),2005,40 (15):1128-1130.4 Li F, Feng J, Cheng Q, et al. Delivery of 125I-cobrotoxin after intranasal administration to the brain: a microdialysis study in freely moving rats J. Int J Pharm, 2007, 328(2):1

23、61-167.5 Alpar HO, Somavarapu S, Atuah KN, et al. Biodegradable mucoadhesive particulates for nasal and pulmonary antigen and DNA delivery J. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57(3): 411-430.6 Coppi G, Iannuccelli V, Leo E, et al. Chitosan-alginate microparticles as a protein carrier J. Drug Dev Ind Pharm, 2001, 27(5): 393-400. 7 Desai KG, Park HJ. Encapsulation of vitamin C in tripolyphosphate cross-linked chitosan microspheres by spray drying J. J Microencapsul, 2005, 22(2): 179-192.8 CUN D M，CUI F D，GUAN Y，et