真性红细胞增多症的细胞遗传学研究

1、真性红细胞增多症的细胞遗传学研究     【摘要】  为了研究真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)的细胞遗传学特点，并探讨间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术在检测PV中8三体和9三体的价值，采用常规细胞遗传学(conventional cytogenetics, CC)技术检测50例初诊PV患者，用间期FISH技术检测PV患者中的8三体和9三体，并以8名正常人骨髓细胞作为对照。 结果表明：50例PV患者中CC检出3例核型异常，1例为8三体，1例为Y染

2、色体缺失，1例为11号染色体倒位。FISH检测2例为8三体，1例与CC检测结果一致。CC未检出9三体， FISH检出1例9三体。 结论：PV患者中染色体异常发生率偏低，其中8三体和9三体发生率略低于国外报道，可能与样本的选择及数量的大小有关；间期FISH技术对检测三体有重要价值，是CC的重要补充。 【关键词】  真性红细胞增多症 荧光原位杂交 细胞遗传学    Cytogenetic Analysis in  Patients with Polycythemia Vera      Abstra

3、ct    In order to evaluate the incidence of chromosomal abnormalities in patients with polycythemia vera(PV) accurately and to investigate the value of fluorescence in situ hybridization (FISH) technique in the detection of trisomies 8 and 9, conventional cytogenetics (CC) technique w

4、as used  to detect karyotype and interphase FISH was used to detect trisomies 8 and 9 in 50 newly diagnosed PV and 8 normal individuals.  The results showed that out of 50 cases, the 3 cases had  chromosome karyotype abnormality, including trisomy 8, deletion of chromosome Y and inver

5、sion of chromosome 11   by CC technique. FISH method detected two cases of trisomy 8, including one  case confirmed  by CC technique, and one case of trisomy 9 neglected by CC technique. It is  concluded that  the incidence of chromosomal abnormalities in patients with&

6、#160; PV is rare, and the incidence  of trisomy 8 and trisomy 9 found in this study are relatively lower than  that have been reported which may be related to the  limited number of samples. Interphase FISH, as an important complement to CC, is a useful method for the detection of tri

7、somies 8 and 9.    Key words    polycythemia vera ; fluorescence in situ hybridization ; cytogenetics    真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)是一种慢性克隆性骨髓增生性疾病。国外报道，PV患者中染色体异常发生率约15%-25%，5、8、9和20号染色体异常多见，其中8号染色体三体(8三体)和9号染色体三体(9三体)是该疾病最常见的染色体数目异常。染色体核型可能对于PV诊断、预后判

8、断和检测克隆消长等具有重要意义1，2。我们采用常规细胞遗传学(conventional cytogenetics，CC)技术检测50例PV患者的染色体核型，同时用间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测50例PV患者中的8三体及9三体，以研究PV的细胞遗传学特点，并探讨间期FISH在检测PV染色体数目异常中的价值。    材料和方法    病例及对照    50例PV患者均为2001年1月至2006年6月在南京医科大学第一附属医院及苏州大学

9、附属第一医院进行染色体核型分析的初诊 PV 患者 。 PV 按文献3标准确诊。50例PV中，男28例，女22例，年龄2576岁(中位年龄52.5岁)。正常对照选用8份血液系统正常的骨髓标本。    探针标记    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(1)真性红细胞增多症的细胞遗传学研究8号染色体着丝粒探针，由法国南特大学医学院医院中心血液实验室的Avet Loiseau教授惠赠，SpectrumGreen及Nick Translation试剂盒购自美国Vysis公司,采用缺口平移法标记。荧光素

10、SpectrumAqua直接标记的9号染色体着丝粒探针购自Vysis公司。标记探针-20保存备用。    CC分析    应用肝素抗凝取患者骨髓, 经短期(24小时)培养法37培养后, 常规收获, 核型分析采用R带显带技术。核型异常描述按人类细胞遗传学国际命名体制(ISSN)(2005年版)，至少2个细胞有3条8号染色体或3条9号染色体定义为8三体或9三体。    FISH分析    采用直接间期FISH检测。取出储存于-20的染色体标本，换用新鲜的31甲醇/冰醋酸，滴片，于

11、37 2×SSC中30分钟，以70%、85%和100%的乙醇室温梯度脱水，每梯度2分钟，在变性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中72变性3分钟，以70%、85%和100%的冰乙醇(-20)梯度脱水，晾干；将1  l SpectrumGreen标记的8号染色体着丝粒探针(或SpectrumAqua标记的9号染色体着丝粒探针)与杂交液9  l混合，在72水浴中变性5分钟，然后加于染色体标本上，盖上盖玻片，用胶封片后放入预热的湿盒中，37杂交16-18小时；杂交后标本在72  0.4×SSC/0.1% Tween20中洗涤2分钟，继之在0.

12、4×SSC/0.3% Tween20中室温洗涤1分钟 ,避光晾干后加含DAPI的抗褪色液复染标本。    荧光显微镜检查    用Leica DMRA2荧光显微镜在FITC单色滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，绿色信号即为8号染色体，蓝色信号即为9号染色体。每例分析500个间期细胞，不计数重叠细胞。    统计学处理    用统计软件SPSS 10.0对实验结果进行统计处理，采用Fisher确切概率检验。    结 &

13、#160;  果    正常对照组    染色体核型分析显示，8名对照者均为正常核型。FISH检测8三体时，结果出现3个绿色荧光信号的间期细胞，发生率为0.2%-2.2%，其均数为1.45%，标准差为0.75%。依据文献报道的正常界限确定方法(±2SD)设定本研究正常值为小于2.95%，故将>2.95%的3个绿色信号者确定为8三体；FISH检测9三体时，结果出现3个蓝色荧光信号的间期细胞的发生率为0.5%-2.8%，其均数为1.38%，标准差为0.75%，设定本研究正常值为小于2.88%，故将>2.88

14、%的3个蓝色信号者确定为9三体。    CC检测染色体核型    50例PV患者中，46例为正常核型，1例未见分裂相，3例具有克隆性染色体异常。在此3例中1例为8三体，1例为Y染色体缺失，1例为11号染色体倒位。染色体异常发生率为6%。    FISH检测8三体及9三体    50例PV患者中，48例3个绿色荧光信号细胞<2.95%，2例3个绿色荧光信号细胞>2.95%(9.4%、48.8%)，PV患者中8三体的发生率为4%。50例PV患者中，49例3个蓝色荧光信号细胞<2.88%，1例3个蓝色荧光信号细胞>2.88%(5%)，PV中9三体的发生率为2%（表1，图1、2）。     FISH与核型的关系    由于受细胞分裂周期的影响，以及所分析的中期细胞数量的限制，难以估计中期染色体分析是否能全面地反映患者体内的克隆的大小。表1显示1例CC检测为8三体的患者中，FISH检测结