第五章 间接凝集反应技术

1、第五章间接凝集反应技术(Indirect agglutination reaction technique)一、 概述（一）原理可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为：敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；快速： 一般1h2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；特异性强；使用方便、简单。（二）载体具

2、有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。良好载体有如下几点基本要求：在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；大小均匀；比重与介质相似，短时间内不能沉淀；无化学或血清学活性；吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。（三）间接凝集的分类1根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。 2根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体

3、）。 3根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。 4根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。二、 间接炭凝反应（一）原理 间接炭凝集反应简称炭凝。它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。（二）材料与试剂 1炭粉 炭粉粒子最好大小在0.12mm0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300目寸的标准筛以300rmin离心去沉淀，再以3 000

4、rmin离心去上清，收集沉淀物。 2高免血清 3待测标本 4灭活兔血清 5正常血清 6标准抗原 70.05mol/L pH7.2PBS液 81硼酸的PBS液（三）操作方法 1炭致敏 取湿炭粉0.25g（干粉0.10g），加入经5660灭活30min的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37致敏30min，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS液洗涤3次。最后一次用含1硼酸和1兔血清的PBS液洗涤一次，离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4冰箱中保存，一年内有效。 2取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小格，加被检标本0.1

5、0ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混匀，静止1min5min，判定结果。同时设三个对照：免疫炭血清+标准抗原。正常炭血清+标准抗原。正常炭血清加待检抗原。（四）结果判定在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：“”：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。“” ：炭粉大部分凝集，液体透明。“” ：炭粉一半凝集，液体较透明。“” ：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。“” ：炭粉不凝集，液体不透明。炭凝以“”做为反应滴度的终点。三、 反向间接乳胶凝集反应（一）原理同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6m0.7m的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性能。间接乳胶凝集目前已用于鼠

6、疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。（二）材料与试剂1聚苯乙烯乳胶2免疫血清3正常血清4标准抗原5待检抗原60.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液硼砂 6.67g硼酸 8.04gH2O 加至 1 000ml 7生理盐水（三）操作方法1乳胶液制备 取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25倍稀释的乳胶液。2乳胶致敏 在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml0.70ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。镜下检查应无自凝。使用时，应与一定稀释度的相应抗原出

7、现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。加防腐剂后，于冰箱内保存。注意防止冰冻。同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。3取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。（四）结果判定 “”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。 “” ： 大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。 “” ： 半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。 “” ： 较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。 “” ： 全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。 以“”作为该反应滴度的终点。四、 间接红血球凝集反应间接红血球凝集反应（简

8、称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。（一）原理以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。（二）材料与试剂1红血球2反应板 分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型

9、的血清效价高12孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用0.5甲醛溶液，1新洁尔灭及紫外线照射等。 3稀释棒 由合金制成。棒头有8条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。它的作用是蘸取、转移、混合液体。为了长期保持棒头的氧化层，每使用20次左右，应过火焰一次。 4标准滴管 每滴0.025ml。 5微型振荡器 6兔血清盐水 作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4保存。同时，取所需量加4倍量的2.5血球悬液，混匀，37水浴10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以pH7.2PBS稀释成1兔血清盐水，冰箱

10、保存可供数日内之用。7抗原 尽可能使用高纯度的抗原。8供试血清或其它含抗体材料 供试血清必须灭活，加9倍2.5的红血球悬液，37水浴10min20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1:10的血清稀释液。9醛化剂 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。10优质鞣酸110.15Mol/L pH6.4PBS液，用于红血球致敏。120.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀释液。130.02牛血清白蛋白PBS液14生理盐水（三）红血球的处理 1新鲜红血球 新鲜红血球用阿氏液保存于4，可供3周内使用。采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出12个滴度。但用新鲜红血球致敏后，

11、保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。2红血球醛化极其优点（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。甲醛醛化过程：将红血球用pH7.2PBS反复洗涤4次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；按18的比例取红血球（压积）和3甲醛液（用pH7.2PBS稀释，预先冷却至4），缓慢混合，加胶塞4作用24h，不时摇动；倾去上清液，再以12（VV）加入3638冷的（10）甲醛溶液，混匀，再放入424h；离心去上清，以生理盐水反复洗涤4次。彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10悬液甲醛化红血球，加1万

12、硫柳汞防腐，4保存。戊二醛醛化过程：取新鲜红血球，以生理盐水洗涤4次；以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1戊二醛溶液，4保存备用；将100ml 1冰冷的戊二醛液加入到10ml15ml红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；离心去上清，以生理盐水洗涤4次，最后以PBS液（或生理盐水）配成10悬液，加1万硫柳汞，4保存。丙酮醛甲醛双醛化过程：取新鲜红血球，洗涤4次，配成8的悬液；于红血球悬液中加等量的3丙酮醛室温电磁搅拌16h18h；洗涤5次，再配成8的悬液；于红血球悬液中加等量的3甲醛，电磁搅拌16h18h；洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS配成10的悬液，加1万硫柳

13、汞防腐，4保存。（3）醛化红血球的优点：性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；重复性好，易标准化。可较长期保存，醛化后4保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。（4）影响醛化的因素：红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37。但有人认为应于4进行醛化；醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以3醛化浓度为宜。家禽红血球一般醛化12次即可，而哺乳动物红

14、血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同，表51是各种双醛化法的结果比较。表51 各种双醛化红细胞的结果比较双 醛 化上海第六人民医院首都医院国外资料抗原滴度 抗原滴度脉冲min抗原滴度脉冲min丙酮醛甲醛戊二醛丙酮醛丙酮醛戊二醛217219215211510751182×1066×1066×106168421543750脉冲min是131I标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。但是从表51中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。 适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形

15、成。但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。 3红血球鞣化 多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。有人认为双醛化后可不必进行鞣化。首都医院做了“丙酮醛甲醛鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。(1) 鞣化过程：将10醛化红血球用生理盐水洗涤2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗涤1次，最后以PBS配成2.50悬液；称取优质鞣酸20mg，以生理盐水4ml配成1200的浓度，于37水浴，使之充

16、分溶解，然后再以pH7.2PBS稀释成12 000的浓度。当天配制、当天用完；1份2.5红血球悬液与1份12 000鞣酸液充分混合，37水浴10min，1 500rmin离心，去上清，用PBS液洗涤1次；以0.02牛血清白蛋白PBS液洗涤1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5鞣化红血球。（2）影响鞣化的因素：鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状，不呈面粉状，有折光性；鞣酸的浓度：浓度过高，可以出现红血球的凝集现象；浓度过低，达不到红血球的活化作用。醛化过的红血球所采用的鞣酸浓度一般比新鲜红血球高10倍。通常以1：2 000为佳；鞣化时间：鞣化过程一般10mi

17、n15min即可完成。时间再长也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化时采用的pH对吸附抗原和血凝滴度影响不大，一般采用pH7.2的PBS液。（四）红血球的致敏 1致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用24个单位计量进行致敏。2致

18、敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：所需浓度的抗原 1 份pH6.4PBS液 4 份2.50的鞣化红血球悬液 1 份混匀，置37水浴30min，离心，沉淀后，以2.5兔血清生理盐水洗涤1次，悬浮于1份兔血清生理盐水中。3影响红血球致敏的因素 要有高纯度或高效价的抗原或抗体。被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以g/ml IgG为宜。抗猪瘟IgG一般用80g/ml160g/ml，抗口蹄疫IgG 20g/ml40g/ml，抗猪水泡病IgG 130g/ml160g/ml，抗猪肺疫IgG 30g/ml 40g/ml，抗猪弓形体20g/ml40g/ml，抗原一般用0.2

19、mg/ml1mg/ml。致敏温度：一般为37，范围是2040。致敏时间：一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。血球浓度：一般为1，范围为0.51.5。（五）操作方法可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。每次试验需做下列对照：血清对照：最高浓度的血清鞣酸血球；鞣酸血球对照：兔血清

20、盐水鞣酸血球；致敏血球对照：兔血清盐水致敏血球；标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。（六）结果判定：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。 ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。 ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。 ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。± ：较“”面积更小，中央有沉积的红血球。 ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。以“”为滴度终点。五、 间接血凝检测多杀性巴氏杆菌荚膜抗原（一）材料与试剂1绵羊红血球2标准多杀性巴氏杆菌荚膜菌种A、B、D、E。3待测荚膜群的多杀性巴氏杆菌4戊二醛（G.R.）5pH7.2的PBS液6阿氏液（

21、Alserers）葡萄糖 2.05g柠檬酸钠（5H2O） 0.80g柠檬酸（H2O） 0.05g NaCl 0.42g H2O 加至 100.00ml 混合过滤，8磅15min灭菌备用 。（二）操作方法1多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备 在血清裂解血琼脂平板上筛选待测的多杀性巴氏杆菌荧光性典型的菌落（荧光性弱的可通过小白鼠或本动物复壮），接种于血清裂解血琼脂斜面或改良马丁汤琼脂斜面，每株接两管，于37培养16h左右，达融合生长后，用2ml生理盐水（每管1ml）洗下，收集于小试管中，于56水浴30min，然后以8 000rmin离心30min，取上清液即可。5红血球 100ml2.5戊二醛溶液 20

22、ml混合后以磁力搅拌器室温搅拌1h，用生理盐水洗涤4次，再用pH7.2PBS液配制成50的醛化红血球悬液（即加至原血量的体积），加1万硫柳汞防腐，分装小瓶，置4保存备用。3红血球致敏 2ml荚膜抗原加入50醛化红血球悬液0.20ml，充分混匀，37作用2h，中间轻轻振荡数次，离心去上清，再用生理盐水洗涤一次，最后加入10ml生理盐水，混匀，即为1的致敏红血球液。4荚膜高免血清的制备和处理 选Cartor A、B、D、E 标准菌株分别接种于马丁琼脂斜面，37培养10h18h，以灭菌生理盐水洗下，加福尔马林处理，使其达0.3福尔马林菌液浓度为200亿ml300亿ml的悬液。选一岁左右的健康绵羊作为

23、制备荚膜高免血清用的动物。第一次皮下注射加有氢氧化铝佐剂的死菌抗原2ml，23周后开始用不加佐剂的死菌悬液，每周注射2次，剂量为1ml，1ml，2ml，2ml，3ml，3ml，10ml，最后放血，常规收获血清，即为荚膜定型用高免血清。取A、B、D、E标准荚膜高免血清 2ml，置56灭活30min，加入50醛化红血球0.4ml，37作用2h，离心去红血球即可。5反应术式，见表5-2(在最后 )各成分加毕后，充分摇匀，置室温中2h3h观察结果。（三）结果判定 ： 凝集的红血球铺得较宽，或卷边或有缺口。 ： 凝集的红血球平铺管底，呈沙撒布。分布不均匀，边缘不整齐。 ： 凝集的红血球面积较小，凝集程度轻微。 ： 红血球形成小而光滑的圆点或有空心。 以“”为样品的滴度终点。六、 反向间接血凝检测猪传染性水泡病病原（一）材料与试剂1高免血清 以猪传染性水泡病乳鼠毒苗免疫成年猪，10天后攻毒，攻毒后蹄部发生水泡。四星期后第二次攻毒，再过二星期，放血收集血清。2免疫球蛋白IgG的提取 以高免血清加等量0.01Mol/l pH 7.0 PBS,逐步滴加饱和硫酸