神经环路的形成、功能与可塑性

1、项目名称：神经环路的形成、功能与可塑性首席科学家：蒲慕明 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部门：中国科学院二、预期目标本项目的总体目标： 在神经环路层面上解析神经系统发育、功能以及可塑性，同时了解与重要神经系统疾病相关的环路异常的机制。建立从微观的分子/细胞水平研究与宏观的系统/行为研究之间的桥梁。力争在神经细胞的产生和分化、细胞定位、突触形成和修剪、感觉信息的传递、整合与储存、工作记忆和抉择的环路机制、环路形成与功能的异常等前沿研究领域中取得重要进展。五年预期目标: 1) 在神经环路形成分子机制方面，深入认识神经干细胞增殖、分化和命运决定的调控机制；揭示神

2、经元迁移的动力原理和导向机制；进一步阐明神经元极化的胞内外机制；探索神经元树突和突触修剪的分子机制。2) 在神经环路功能及可塑性方面，阐明神经环路电信号的产生与调节机制、多模态感觉信息整合的突触和环路机制、神经环路存储和提取感觉经验中的时序信息的突触机制、工作记忆和抉择行为的环路机制和工作原理。3) 在神经环路异常分子机制方面，将重点研究智障基因导致癫痫易感的环路形成异常、抑制性突触传递系统调控与癫痫发生的关系、离子通道失常对神经元存活与突触和神经环路异常的作用。4) 五个课题有机联系、技术交叉。将充分利用团队优势，在以上三个研究方向取得重要科研成果。具体表现为对神经环路的重要前沿问题有显著突

3、破，在神经科学界取得领先地位。5) 开展与临床研究人员的交流与合作关系，以扩展具有临床应用前景的基础研究。6) 培养学术骨干的基础科研能力，使之成为他们所在的研究领域中享有国际声誉的科学家。建立具有国际竞争力的创新型研究团队。通过高质量的基础研究训练来提高研究生和博士后的科研素质，为中国神经科学后备人才的储备作出贡献。三、研究方案本项目由五个有内在联系的研究课题组成，每个课题由3-4个神经科学研究所的研究组合作完成。这些课题紧密围绕神经环路的形成及功能展开研究。在神经环路的形成及可塑性方面，主要研究神经元发生、分化和命运决定的转录因子调控；神经细胞迁移和形态发生的分子细胞学机制；突触形成与修剪

4、机制；并从分子细胞层次研究环路功能的调节机制。在神经环路的功能及可塑性方面，主要研究多模态感觉信息整合的环路机制；以及工作记忆和抉择的环路基础。同时，将研究病理状态下（包括癫痫、智障和老年痴呆）神经环路的变化。五个课题的研究方案，依以下顺序分别进行描述：环路的形成环路的功能环路的异常。课题一 神经细胞的产生、迁移与轴突生长结合基因剔除、胚胎电场转基因、组织培养、单细胞迁移分析、高通量测序和数据分析等实验方法，研究大脑皮层和脊髓背角神经元产生和命运决定的调控机理、神经元迁移及轴突投射建立的机制。并将这两个脑区的研究结果相互参照，比较异同。在神经元产生和命运决定的调控机制研究中将特别关注三类调控方

5、式： 1）转录调控、2）表观遗传学调控、3）miRNA调控，以期发现有关键作用的新的调控分子、阐明相应的上下游信号机理。神经元迁移和轴突投射的研究中，特别关注已知的神经轴突导向因子对新生神经元迁移发挥的作用、阐明相关的信号机制。创新点与特色：在研究内容上，综合考虑不同层次的基因表达调控网络在神经干细胞命运决定中的作用；将在大脑皮层和脊髓背角上的研究结果相互比较和参照，以促进对各脑区神经环路发育机制的一般性了解。在实验方法上，拥有非常成熟的单细胞迁移导向分析等独特技术。可行性分析：已建立实验必需的鸡胚和鼠胚电场转基因、单细胞迁移导向分析、神经干细胞培养、病毒包装感染等关键技术。成功获得了多个与研

6、究相关的转基因小鼠品系。研究队伍完整、具有良好的工作基础，具备开发新的研究手段的潜力。因此，本课题的执行有充分的保障。课题二 神经环路形成和可塑性的分子机制围绕神经元极性建立、轴树突的生长、突触形成、树突与突触的选择性修剪等重要问题，开展以下研究：1）神经元形态发生的细胞骨架机制和不对称膜转运机制；2）神经元电活动、分泌性因子对树突形成与修剪和突触功能的影响；3）表观遗传因素介导的基因表达调控对神经环路可塑性的影响。创新点与特色：围绕神经元形态发生、突触的形成及修剪机制，从细胞骨架、囊泡转运、基因表达调控等多层次多角度地展开研究。在离体培养的神经元上，采用多种新的分子生物学、光学成像和激活等实

7、验手段。可行性分析：主要学术骨干在神经元形态发生、突触形成及神经活动依赖的基因表达调控等方面有多年的研究工作积累。已获得一些与本课题相关的前期工作成果。具有相对成熟的神经细胞生物学分析手段、工具病毒载体构建技术和光敏感离子通道激活技术。课题三 神经环路信号传递、整合与储存本课题拟采用多种模式动物（果蝇、斑马鱼、大/小鼠）和多种活体实验手段（电生理、钙成像、行为等）研究视觉、听觉、嗅觉、味觉等多模态感觉信息传递、整合与储存发生的精确位点和神经机制，探讨其对动物行为的作用。创新点与特色：采用多种模式动物，从不同角度研究多模态感觉信息整合的原理；运用在整体果蝇、斑马鱼、大/小鼠上的活体全细胞记录技术

8、与钙成像相结合的手段，并引入光敏感离子通道激活和失活神经环路的技术。可行性分析：已建立完善的实验体系，主要学术骨干在以上研究领域均有较好的工作积累，已获得一些与本课题相关的前期工作成果，有望取得进一步的突破。课题四 工作记忆和抉择行为的神经环路基础本课题采用实验和理论相结合的方法，围绕工作记忆和抉择行为的神经环路机制展开深入研究。在实验方面，将以果蝇、小鼠和猴作为模式动物，采用行为学、脑片和整体动物的示踪、光学成像、电生理等技术，以研究工作记忆和抉择行为的神经元环路机制和功能。在理论分析方面，将以实验数据为基础，结合大规模的神经元网络的计算仿真，揭示工作记忆和抉择行为在神经元环路上的计算原理。

9、理论的结果和预测将对动物实验的设计和数据分析提供新的思路。创新点与特色：从分子、细胞、环路、到整体行为等多层次、多角度展开实验和理论紧密结合的研究，揭示神经环路实现工作记忆和抉择行为的机理，以期进一步认识其它认知功能的环路机制。可行性分析：已建立相对成熟的整体动物的钙成像、电生理、动物行为及计算的平台。主要学术骨干在神经元环路的实验记录与操纵、理论的模拟与分析等方面有多年的积累。课题五 神经环路异常的分子机制本课题将结合基因剔除/过表达技术、动物行为分析、影像技术、细胞培养、电生理技术、及生化实验方法，研究与疾病相关的神经环路异常的分子机制。创新点和特色：从神经环路的形成与功能的层面来了解脑疾

10、病发病机理，以期为开发有临床运用前景的预防与治疗方法提供新思路。可行性分析：所需的转基因、基因敲除小鼠已基本构建好，所需抗体已制备。主要学术骨干对正常与异常神经环路的分子机制研究已有多年经验。四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 检测Sirt1对神经干细胞库的影响；研究Ezh2对新生神经元的调控；2. 收集和制备实验所需的各种转基因小鼠；寻找决定Gad67时空正确表达的调控序列；3. 确定Slit/Robo在大脑皮层神经元迁移中的作用及分子机理；4. 发展检测Rab5和Rab10等活性的灵敏FRET探针； 5. 筛选可被神经元电活动调控的，调节树突形态与突触功能的新基因；筛选MeCP2调控基

11、因；6. 鉴定皮层锥体细胞的轴突通道亚型及其电压依赖特性；研究视觉如何调节Mauthner细胞的听觉和行为；7. 通过电生理和钙影像技术寻找果蝇味觉二级和高级神经元以及嗅觉三级神经元；V1神经元集群的时序学习与记忆；8. 建立小鼠的工作记忆的行为范式，光遗传手段，以及相关生理和行为学的检测；研究果蝇中抉择行为的动态性，及其涉及的神经环路与机制；9. 建立生物学上合理的大尺度的神经元环路模型；10. 研究CDKL5和MeCP2的相互关系。特异敲除ErbB4基因，建立研究A产生和积累的模型；11. 研究GAT1敲除小鼠行为学表型，研究BDNF急性、慢性处理对ASIC表达及功能的调控作用。 1. 获

12、得Sirt1调控神经干细胞增殖的数据；获得Ezh2调控神经元发育的初步数据；2. 找到决定Gad67在脊髓中时空正确表达的调控序列，获得nestin转基因小鼠等多种小鼠；3. 完成Slit/Robo调节大脑皮层神经元迁移的工作，整理并撰写论文；4. 获得检测Rab及蛋白酶的灵敏方法；5. 完成基因芯片筛选；得到MeCP2调控基因表达的全面数据，确认MeCP2对突触发育的作用；6. 阐明锥体细胞动作电位爆发的离子机制；揭示视觉对听神经-Mauthner细胞听觉通路的作用；7. 发现果蝇味觉二级和高级神经元以及嗅觉三级神经元；发现诱导和巩固时序学习的条件；8 建立生理、解剖、光遗传、行为等研究工作

13、记忆的实验方法，揭示多巴胺，五羟色胺以及GABA分别在强化学习和抉择行为动态性调控中的不同作用；9 初步探讨网络的动力学性质，为后期细致模拟工作记忆和抉择行为做准备；10 阐明CDKL5和MeCP2的上下游关系，建立ErbB4的条件敲除小鼠，建立检测A的系统。发现TRPC6对A水平的调控作用；11 确认GAT1敲除小鼠的精分表型，确定BDNF对ASIC的敏化调控作用。第二年1. 确定Sirt1的表型；通过体内Ezh2抑制实验以及miR-26过表达实验来阐述两者的相互作用；2. 分析nestin转基因小鼠脑内表型；分析神经细胞中是否存在细胞特异性基因组DNA重组；3. 研究迁移神经元中极性黏附受

14、RhoA/myosin和极性信号复合物Par3/Par6/aPKC的影响；4. 研究Rab5、Rab10、Calpain以及Caspase3的时空激活规律；5. 对基因芯片筛选出的基因进行鉴定与确认；建立MeCP2转基因小鼠筛选在不同组织特异性高表达和敲除MeCP2的小鼠；6. 测定抑制性中间神经元动作电位爆发的位点，研究多巴胺神经系统如何调节视觉对听觉功能和行为的调节；7. 研究视觉信号对果蝇嗅觉和神经元嗅觉反应的影响；研究皮层活动状态对时序学习和记忆的影响；8. 研究对前额叶投射神经元的精细连接规则。观察到的模式动物在工作记忆和抉择任务中的行为规律，完善工作记忆和抉择行为的神经元环路模型；

15、9. 观察kenyon神经元轴突与用多巴胺、octopamine、GABA等为递质侵入蘑菇体内的神经元纤维末梢的联接规则及支配关系；10. 研究敲除ErbB4基因的小鼠癫痫发生发展过程，研究钙离子是否介导RPC6对A水平的影响；11. 研究GAT1敲除小鼠中前额叶脑区GABA能紧张性电流；研究BDNF-TrkB信号通路对ASIC的影响，寻找ASIC上精胺敏化的位点。1. 基本完成Sirt1调控的作用方式，整理撰写研究论文，基本完成对Ezh2与miR-26相互作用机制的探索；2. 初步明确在Glu能神经元中表达外源基因能否改变其递质表型。确定神经细胞中是否存在细胞特异性基因组DNA重组；3. 明

16、确迁移神经元中极性黏附建立的机制，整理撰写论文；4. 明确Rab10等小G蛋白的可能作用机制；5. 完成对基因芯片筛选出的基因的鉴定与确认；获得MeCP2转基6小鼠模型；6. 探讨抑制性中间神经元的动作电位产生和传播机制，揭示间脑多巴胺神经环路在视觉对听觉调节中的重要作用；7. 发现果蝇视嗅觉整合的位点；发现影响皮层时序学习与记忆效率的因素；8. 初步阐明工作记忆和抉择行为相关环路的连接方式，完善工作记忆和抉择行为的神经元环路模8型；9. 了解果蝇蘑菇体内各种类型神经纤维之间的支配关系和联系紧密程度，构建计算模型预测这些行为对环路之间关联紧密程度的依赖关系；10. 揭示Neuregulin1-

17、ErbB4信号通路在癫痫发生发展中的作用，确定过表达TRPC6下调A的作用；11. 确认GAT1的作用机理，明确在体情况下BDNF对ASIC的影响和对痛觉的贡献，.找到精胺增强ASIC的作用位点。第三年1. 研究Ezh2对神经干细胞产生新生神经元以及神经元发育的调控机制；2. 分析NP1,NP2条件敲除小鼠脊髓背角神经元的轴树突投射是否发生异常；3. 研究Rab10效应蛋白对神经元极化的影响；4. 研究新筛选出基因对树突发育与突触功能的调节作用；观察MeCP2转基因小鼠中突触发育是否受到影响；5. 研究神经调质受体与Na+通道亚型在轴突始段的共存关系，研究Mauthner细胞上的视觉输入如何受

18、到多巴胺系统的门控；6. 检测对味觉和嗅觉都有反应的神经元的性质；研究STDP在初级视皮层群体神经元中的作用；7. 记录多巴胺等神经调质如何改变神经元内在兴奋性和突触传入。观察在气味编码、强化学习及抉择等神经过程中与多巴胺能神经元的活动相关联的蘑菇体小叶兴奋模式的变化；8. 建立猴等模式动物的工作记忆范式。完善抉择行为的神经环路模型；9. 研究MeCP2和CDKL5特异性基因敲除小鼠的神经元存活，Ube3A在神经元环路建立和功能维持中的作用，研究TRPC6下调A水平机制；10. 检测GABA系统相关药物对于小鼠类精分症状的影响，研究精胺敏化ASIC对神经元兴奋性的影响。1. 完成Ezh2对神经

19、元产生和发育的调控方式，整理撰写论文；2. 确定NP1及NP2如何指导脊髓背角神经元轴树突的生长投射，整理并撰写论文；3. 完成Rab10对神经元极化作用机理研究；完成在体检测N-cadherin功能的转基因小鼠的构建；4. 完成不同脑区神经元的形态发生鉴定，初步得到MeCP2调控树突棘发育的体内证据；整理数据、撰写论文；5. 揭示神经调质对轴突Na+通道的调制作用及其机制；揭示视觉输入的动态门控机制和行为意义；6. 发现果蝇味觉和嗅觉整合的整合位点；发现参与V1时序学习与记忆的神经环路；7. 深入阐明工作记忆相关环路的连接方式，了解蘑菇体的小叶对感觉刺激和奖惩刺激编码的一般原则；8. 建立猴

20、的工作记忆行为范式，完善描述脑的抉择行为的神经环路模型；9. 阐明MeCP2，CDKL5和Ube3A在神经元发育中的作用，确定分泌酶或降解酶的作用；10. 明确Ca2+信号及其下游通路在慢性痛诱发和维持中的作用，研究精胺增强ASIC对神经元兴奋性的影响。第四年1. 继续研究miR-22以及其它miRNA对新生神经元调控的作用机制；初步探讨疾病模型下神经干细胞增生以及分化的作用方式；2. 利用DiI示踪法，研究c-Kit条件敲除的小鼠中皮层丘脑束发育有无异常；3. 研究丰富环境饲养的范式可否影响电活动依赖的树突与突触修剪的可塑性；4. 研究MeCP2调控的基因表达是否对树突棘的发育与修剪产生影响

21、；完成Rab对神经递质受体转运的影响的研究；5. 探讨神经调质对动作电位传播能力的影响；研究斑马鱼视顶盖如何整合视觉和听觉的输入；6. 检测不同视觉刺激模式对嗅觉反应的影响；神经调质系统对STDP和时空序列学习与记忆的作用；7. 了解不同性质的阈下膜电位的相关性在工作记忆的不同时相有何规律；8. 建立猴的光遗传手段，观察果蝇在条件化建立和抉择行为过程中，蘑菇体神经元相互之间活动关联性的变化。探讨各种工作记忆机制的合理性；9. 研究敲除ErbB4基因的小鼠的突触传递，MeCP2和CDKL5敲除小鼠的学习行为，研究过表达TRPC6通道影响g分泌酶的活性，检测AD鼠中过表达TRPC6通道对学习和记忆

22、能力；10. 检测GAT1敲除小鼠类精分症状的作用, ASIC如何参与BDNF对于神经环路的调节作用。1. 完成miR-22对新生神经元调控机制的研究，整理撰写论文。初步建立用于神经干细胞研究的体内疾病模型；2. 初步确定SCF/c-Kit是否参与皮质丘脑束发育的调控；3. 完成Calpain和Caspase3完成新筛选出基因对树突发育与突触功能的调节作用的研究；4. 确证MeCP2上下游分子是否参与树突棘发育与修剪的过程；整理数据、撰写并发表论文；5. 阐明神经调质对突触可塑性的调节作用及机制；揭示中脑视觉和听觉整合的功能特点；6. 发现视觉模式对嗅觉反应的调控机制；揭示不同生理状态下视觉知

23、觉记忆巩固的机制；7. 阐明学习如何改变工作记忆和持续性发放以及相关神经元活动。建立猴的光遗传手段和电生理记录手段；8. 了解蘑菇体神经元与其他侵入蘑菇体小叶的神经元在行为过程中活动关联性的变化趋势及相应的调控模式。完善工作记忆的神经元环路模型；9. 阐明MeCP2、CDKL5和UBE3A突变致神经环路发育异常的机制，阐明TRPC6调控分泌酶，确定AD鼠中TRPC6通道对学习和记忆的影响；10. 确认GAT1对小鼠类精分症状的影响，明确BDNF/TrkB-ASIC调控途径在痛信号传递和维持过程中作用的重要性。第五年1. 完善非神经细胞转分化为神经元方面的工作。探讨成年神经干细胞维持，沉默，以及

24、激活的调控方式；2. 离体实验研究SCF是否通过c-Kit促进皮层深层神经元轴突的黏附生长；3. 继续完善与优化脊髓背角神经元环路分析方法。4. 寻找可能对缺失或过多MeCP2造成树突棘发育和修剪异常的分子途径进行挽救的途径和方法；5. 研究皮层网络活动状态对神经元反应性的调节；研究视觉和听觉整合如何受到多巴胺系统的调节；6. 研究果蝇视觉对嗅觉影响的位点，STDP对于初级视皮层时序学习与记忆的充分性和必要性；总和五年的各个相关子课题的工作；7. 记录神经元的突触可塑性对工作记忆和持续性发放的相关性，研究清醒猴的神经元在工作记忆中的环路群体活动的规律，对已建立的工作记忆和抉择行为的神经环路模型

25、归纳汇总；8. 建立和完善果蝇社会学习和群体抉择范式；8 验证分析MeCP2和CDKL5对突触可塑性和神经环路的影响; TRPC6通过下调A的产生减少其对突触的毒性，改善了行为; GABA对前额叶神经网络活动的影响；探索合成相关针对BDNF敏化ASIC的干扰肽；研究ASIC精胺敏化的抑制剂对神经保护作用；9 总结并撰写论文。1. 初步取得一些基因是如何调控神经干细胞激活或沉默的的数据；2. 基本完成SCF/c-Kit对皮质丘脑束发育调控作用的研究，整理并撰写论文；3. 整理脊髓背角神经元环路方面的工作；4. 完成神经电活动调节树突、树突棘修剪机制的研究；明确MeCP2的作用机制；5. 整理数据

26、、撰写并发表论文；6. 揭示网络活动状态在感觉信息整合中的作用机制；揭示视觉-听觉整合的动态调节机制及其行为意义；7. 找到介导果蝇味嗅觉整合的神经环路；阐明初级视皮层时序学习与记忆的神经机制；8. 阐明工作记忆和持续性发放中单个细胞与群体细胞活动的关系，阐明猴神经元在工作记忆中的群体活动规律；9. 完善神经环路模型，用模型解释所观察到的所有的实验现象；了解压力环境对群体抉择行为的影响以及相应的神经环路基础；10. 阐明MeCP2和CDKL5突变致认知功能异常的细胞学基础，提出对AD发病机理的新认识，阐明GABA系统与精神分裂症发病机理的关系；揭示ASIC敏感化调控的分子基础并发现缺血性神经损

27、伤和慢性痛治疗新靶点；11总结结果，发表论文。一、研究内容围绕神经环路的形成、功能与可塑性这一主题，所建议的五个研究课题将用各种实验手段力争在神经环路的形成过程、信息编码和处理的功能、及神经环路的可塑性等方面取得重要突破。以下将按课题顺序叙述拟解决的关键科学问题和主要研究内容。神经环路的形成、功能和可塑性神经环路的形成神经环路的功能神经环路的功能异常神经细胞的产生、迁移和轴突生长神经环路形成与可塑性的分子机制神经环路信号传递、整合与储存工作记忆和抉择行为的神经环路基础神经环路异常的分子机制课题一 神经细胞的产生、迁移与轴突生长神经系统早期发育过程中，神经干细胞的增殖、分化产生不同类型的神经元，

28、以及新生神经元的迁移定位和轴突投射到特定的部位对于功能性神经环路的形成是必不可少的环节。细胞内转录因子和miRNA及胞外诱导因子对这些发育环节发挥重要的调控作用。根据该领域研究现状和热点，结合本研究团队的前期工作基础，拟解决的关键科学问题和主要研究内容如下：本课题的关键问题：1） 神经干细胞增殖分化和命运决定的调控机理；2） 神经元迁移和轴突生长的导向机制。主要研究内容：1. 大脑皮层和脊髓背角神经元产生及神经递质表型决定的转录调控机制；2. miRNA在大脑皮层神经细胞命运决定、定向迁移、轴树突分化、轴突生长导向中的作用；3. 大脑皮层及脊髓神经元有序迁移及轴突投射的导向机制。课题二 神经环路形成与可塑性的分子机制神经元极性建立、轴树突生长、神经元与靶细